Genome-wide identification of key enzyme-encoding genes and the catalytic roles of two 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase involved in flavonoid biosynthesis in Cannabis sativa L.
- 作者
- Xuewen Zhu, Yaeli Mi, Xiangxiao Meng, Yiming Zhang, Weiqiang Chen, Xue Cao, Huihua Wan, Wei Yang, Jun Li, Sifan Wang, Zhichao Xu, Atia Tul Wahab, Shilin Chen, Wei Sun
- 单位
- Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences; College of Life Science, Northeast Forestry University; Center for Molecular Medicine and Drug Research, International Center for Chemical and Biological Sciences, University of Karachi; Institute of Herbogenomics, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2022）
- DOI
- 10.1186/s12934-022-01933-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
系统鉴定大麻（Cannabis sativa）中参与黄酮生物合成的关键酶编码基因，并阐明两个2-氧戊二酸依赖性双加氧酶（CsFLS2和CsFLS3）在黄酮（flavonoid）生物合成中的催化功能，为异源重构大麻黄酮及大麻黄酮素（cannflavins）合成途径提供理论依据。
研究策略
整合基因组、转录组和代谢组数据，通过BLAST同源比对与保守域筛选鉴定11类共56个黄酮合成相关基因，结合不同组织与化学变种中基因表达与黄酮含量的相关性分析，锁定候选CsFLS基因；进一步通过克隆表达、体外酶活测定、分子对接及系统进化分析对CsFLS2和CsFLS3进行功能表征。
核心内容
该研究整合大麻基因组、转录组与代谢组数据，通过同源比对和保守域筛选，系统鉴定了黄酮生物合成途径中11类共56个关键酶编码基因，发现黄酮主要在花、苞片和叶中积累且不同化学变种间含量差异显著。在此基础上重点表征了两个2-氧戊二酸依赖性双加氧酶CsFLS2和CsFLS3，体外酶活实验表明二者均具有双功能催化活性，既能将二氢黄酮醇转化为黄酮醇，又能催化柚皮素3位羟化生成二氢山奈酚；其中CsFLS2对二氢槲皮素的Km为5.49 μM，且能直接将柚皮素转化为芹菜素，展现出类似黄酮合酶I的新功能。两个酶的最适温度和pH各异，启动子分析显示其受防御、低温及激素信号调控。该工作阐明了大麻黄酮合成逐步酶促网络及关键酶底物选择性，为异源重构大麻黄酮及大麻特异性黄酮类化合物合成途径提供了理论基础和催化元件。
创新点
首次在全基因组水平系统鉴定大麻黄酮生物合成途径的11类56个酶编码基因；发现CsFLS2和CsFLS3具有双功能催化活性，既能将二氢黄酮醇转化为黄酮醇，又能催化柚皮素（Nar）3位羟化生成二氢山奈酚（DHK）；CsFLS2还能将Nar直接转化为芹菜素（Api），具有类似黄酮合酶I（FNS I）的活性，揭示了2-ODD酶家族的底物多样性与进化关系。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Cannabis sativa L. | 黄酮生物合成途径 | PAL | 苯丙氨酸解氨酶 | 催化 | 家族成员CsPAL1-7，其中CsPAL2-3和5与黄酮积累正相关 |
| Cannabis sativa L. | 黄酮生物合成途径 | C4H | 肉桂酸4-羟化酶 | 催化 | 家族成员CsC4H1-2，CsC4H1在根、花、苞片中高表达 |
| Cannabis sativa L. | 黄酮生物合成途径 | 4CL | 4-香豆酸辅酶A连接酶 | 催化 | 家族成员Cs4CL1-6，Cs4CL3-4和6可能参与黄酮生成 |
| Cannabis sativa L. | 黄酮生物合成途径 | CHS | 查尔酮合酶 | 催化 | 家族成员CsCHS1-9，多数在花、苞片和叶中表达 |
| Cannabis sativa L. | 黄酮生物合成途径 | CHI | 查尔酮异构酶 | 催化 | 家族成员CsCHI1-4，CsCHI1与黄酮积累正相关 |
| Cannabis sativa L. | 黄酮生物合成途径 | FNS | 黄酮合酶 | 催化 | 家族成员CsFNS1-8，CsFNS1-3和8与黄酮积累相关 |
| Cannabis sativa L. | 黄酮生物合成途径 | F3'H | 黄酮3'-羟化酶 | 催化 | 家族成员CsF3'H1-3，CsF3'H2与黄酮积累正相关 |
| Cannabis sativa L. | 黄酮生物合成途径 | F3H | 黄烷酮3-羟化酶 | 催化 | 家族成员CsF3H1-3，CsF3H1和2分别与黄酮和花色素积累相关 |
| Cannabis sativa L. | 黄酮生物合成途径 | FLS | 黄酮醇合酶 | 催化 | 家族成员CsFLS1-5；CsFLS2和CsFLS3经体外实验验证具有双功能活性 |
| Cannabis sativa L. | 黄酮生物合成途径 | OMT | O-甲基转移酶 | 催化 | 家族成员CsOMT1-3，CsOMT21参与大麻黄酮素A/B/C的甲基化修饰 |
| Cannabis sativa L. | 黄酮生物合成途径 | PT | 异戊烯基转移酶 | 催化 | 家族成员CsPT1-8，CsPT3参与大麻黄酮素的异戊烯基化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 黄酮生物合成途径（体外表达） | CsFLS2 | CsFLS2（黄酮醇合酶2） | 催化 | 重组蛋白在大肠杆菌中表达，催化DHQ和DHK生成黄酮醇，并具有F3H和FNS I样活性 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 黄酮生物合成途径（体外表达） | CsFLS3 | CsFLS3（黄酮醇合酶3） | 催化 | 重组蛋白在大肠杆菌中表达，催化DHQ和DHK生成黄酮醇，具有F3H活性但无FNS活性 |
关键发现
- 鉴定出11类(56个成员)黄酮生物合成关键酶编码基因，分布于不同染色体；黄酮主要在花、苞片和叶中积累，不同化学变种中含量差异显著。体外酶活实验表明CsFLS2对DHQ的Km为5.49 μM，对DHK的Km为16.28 μM；CsFLS3对DHK的Km为75.77 μM，对DHQ的Km为214.4 μM；CsFLS2最适pH
- 5、20°C，CsFLS3最适pH
- 5、15°C。CsFLS2和CsFLS3蛋白分子量分别约为43.86 kDa和45.65 kDa。CsFLS2催化Nar时除产生DHK和山奈酚外还产生芹菜素。相关基因CsFLS2启动子含防御和应激响应元件，CsFLS3启动子含低温、水杨酸和茉莉酸甲酯响应元件。
研究结论
本研究构建了大麻黄酮生物合成的逐步酶促基因网络，明确了CsFLS2和CsFLS3是控制黄酮醇合成的关键酶，且具备额外的F3H活性和底物选择性，CsFLS2还展现FNS I样功能。这为在异源系统或植物培养中重建大麻黄酮及大麻黄酮素生物合成途径奠定基础，也为发现新型大麻特异性黄酮提供了理论依据。