A dual-inducible control system for multistep biosynthetic pathways
- 作者
- Andrés Felipe Carrillo Rincón, Alexandra J. Cabral, Andras Gyorgy, Natalie G. Farny
- 单位
- Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute; Division of Engineering, New York University Abu Dhabi; Program in Bioinformatics and Computational Biology, Worcester Polytechnic Institute
- 杂志
- Journal of Biological Engineering（2024）
- DOI
- 10.1186/s13036-024-00462-z
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
自然界生物合成基因簇的异源表达常需要多基因协同调控，而现有双诱导/多诱导系统多局限于大肠杆菌，且强诱导启动子在未诱导状态下存在泄漏表达，导致无法独立控制多步生物合成途径中的不同基因，也难以在多种革兰氏阴性菌底盘间通用。
研究策略
将本实验室开发的σ70优化的lac和tet表达系统组合为单质粒双诱导系统，在E. coli、P. putida和V. natriegens中系统评估其对两种荧光报告蛋白和番茄红素/β-胡萝卜素生物合成基因簇的独立、并发及协同控制能力；为进一步降低泄漏，在转录调控基础上引入toehold switch翻译调控层，并用高灵敏度luxCDABE报告系统和萜类产物合成验证其动态范围改善。
核心内容
本研究构建了一套基于σ70优化的lac与tet启动子的单质粒双诱导表达系统，并在大肠杆菌、恶臭假单胞菌和需钠弧菌三种革兰氏阴性菌中系统评估其性能。该系统可在同一载体上独立或同时控制两个转录单元，通过aTc和IPTG分别诱导，实现对番茄红素/β-胡萝卜素生物合成基因簇中crtEBI与crtY的分化调控，首次在双诱导回路中实现了番茄红素的细胞内积累，并可在特定诱导条件下完全转化为β-胡萝卜素，双诱导类胡萝卜素总量达935 μg/L。对于强σ70启动子的泄漏问题，作者引入toehold switch作为翻译层调控，使荧光报告系统的未诱导泄漏降至不可检测水平，同时将pSC101低拷贝质粒上未诱导状态的番茄红素产量降低至256 μg/L，较非THS对照低约1.8倍。在P. putida中单表达系统4小时可产番茄红素170 mg/L、β-胡萝卜素496 mg/L。该系统拓宽了非模式革兰氏阴性菌的遗传工具箱，为多基因天然产物途径的异源表达提供了可移植平台。
创新点
['首次将σ70优化的lac和tet诱导启动子系统整合为双诱导表达质粒，能在同一载体中独立或同时控制两个转录单元', '在强σ70启动子中引入toehold switch，形成转录+翻译双重调控，显著降低未诱导状态泄漏并扩大动态范围', '系统比较了双诱导系统在E. coli、P. putida和V. natriegens三种γ-变形菌中的性能、协同效应和代谢负担', '通过分化控制crtEBI和crtY，第一次在双诱导回路中实现β-胡萝卜素合成中间体番茄红素的细胞内积累，并可在特定诱导条件下完全转化为β-胡萝卜素']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH10B; Pseudomonas putida JE90; Vibrio natriegens | 萜类生物合成（番茄红素/β-胡萝卜素） | crtE, crtB, crtI (LYC操纵子) | GGPP合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，置于σ70 V2TcR启动子下，用于番茄红素合成 |
| Escherichia coli DH10B; Pseudomonas putida JE90; Vibrio natriegens | β-胡萝卜素生物合成 | crtY | 番茄红素环化酶CrtY | 催化 | 置于σ70 V2LacI/V3LacI启动子下，将番茄红素转化为β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli DH10B; Pseudomonas putida JE90; Vibrio natriegens | 基因表达调控 | tetR | TetR阻遏蛋白 | 调控 | 组成型表达，响应aTc，控制σ70 V2TcR启动子 |
| Escherichia coli DH10B; Pseudomonas putida JE90; Vibrio natriegens | 基因表达调控 | lacI | LacI阻遏蛋白 | 调控 | 组成型表达，响应IPTG，控制σ70 V2/V3LacI启动子 |
| Escherichia coli DH10B; Pseudomonas putida JE90; Vibrio natriegens | 基因表达调控 | σ70 V2TcR启动子 | σ70 RNA聚合酶 | 调控 | 含σ70共识序列的优化tet启动子，可在多种革兰氏阴性菌中实现强诱导和低泄漏 |
| Escherichia coli DH10B; Pseudomonas putida JE90; Vibrio natriegens | 基因表达调控 | σ70 V2LacI / V3LacI启动子 | σ70 RNA聚合酶 | 调控 | 含σ70共识序列的优化lac启动子，V3版本较V2泄漏更低 |
| Escherichia coli DH10B; Pseudomonas putida JE90; Vibrio natriegens | 翻译调控 | toehold switch (THS) | THS触发RNA与靶RNA | 调控 | 通过toehold介导链置换隐藏RBS，实现翻译水平抑制，降低泄漏 |
| Escherichia coli DH10B | 报告系统 | sfGFP | 超折叠绿色荧光蛋白 | 催化 | 荧光报告蛋白，通过自催化形成生色团，用于检测σ70 V2TcR活性 |
| Escherichia coli DH10B; Pseudomonas putida JE90; Vibrio natriegens | 报告系统 | mCardinal | 远红色荧光蛋白mCardinal | 催化 | 荧光报告蛋白，激发604 nm/发射659 nm，避开底盘自荧光干扰 |
| Escherichia coli DH10B; Pseudomonas putida JE90 | 报告系统 | luxCDABE | 细菌荧光素酶复合体（LuxCDABE） | 催化 | 生物发光报告基因，高灵敏度评估启动子泄漏和动态范围 |
关键发现
- ['双表达系统σ70 V2TcR-sfGFP/σ70 V2或V3LacI-mCardinal中，sfGFP产量较单表达系统提高1.2倍（E. coli、P. putida）和1.7倍（V. natriegens），而mCardinal产量降低6.2倍（E. coli）、2.4倍（P. putida）和2.0倍（V. natriegens）', '协同性实验中，E. coli双系统同时添加aTc和IPTG使mCardinal产量比单独aTc提高1.5倍，但未超过单一σ70 V2TcR系统的最大产量，表明无真正转录协同效应', 'P. putida双系统中IPTG诱导的mCardinal产量比单表达系统降低3倍
- V. natriegens中分别降低12倍（V2LacI）和2倍（V2TcR）', 'σ70 V2TcR单表达系统在E. coli中经4 h诱导可产0.8 mg/L番茄红素和0.46 mg/L β-胡萝卜素（未做培养基或菌株优化）', 'σ70 V2TcR单表达系统在P. putida中4 h诱导产番茄红素170 mg/L、β-胡萝卜素496 mg/L
- 在V. natriegens中产番茄红素286 mg/L、β-胡萝卜素353 mg/L', '在pSC101低拷贝质粒上，σ70 V3-2LacI-THS在未诱导状态下仍产生256 μg/L番茄红素和151 μg/L β-胡萝卜素，比pColE1中非THS的σ70 V2TcR泄漏水平低约1.8倍', 'IPTG诱导σ70 V3-2LacI-THS后番茄红素产量达588 μg/L、β-胡萝卜素达507 μg/L', '双THS回路（σ70 V2TcR-THS-crtY / σ70 V3-2LacI-THS-crtEBI）在E. coli中实现同一细胞内番茄红素与β-胡萝卜素同时积累
- 添加aTc后番茄红素被迅速完全转化为β-胡萝卜素，双诱导条件下类胡萝卜素总量达935 μg/L', '加入toehold switch后，σ70 V2TcR系统在用荧光报告检测时未诱导泄漏降至不可检测水平']
研究结论
本研究成功构建了一套可跨E. coli、P. putida和V. natriegens等γ-变形菌底盘使用的双诱导σ70 lac/tet表达系统，能够独立控制多基因生物合成途径中的不同基因。通过整合toehold switch在翻译水平增加调控层，显著降低了强启动子的泄漏表达，使β-胡萝卜素途径中间体番茄红素能够积累并随后被诱导转化为最终产物。该工具拓宽了非模式革兰氏阴性菌的遗传工具箱，为异源表达生物合成基因簇、天然产物及重组蛋白提供了可移植的基因表达平台。