A new Clonostachys Sp. ZBS49 filamentous fungus with high production of betulinic acid and its inhibitory effect on liver cancer cells
- 作者
- Luran Geng, Jiale Cui, Changyixin Xiao, Linlin Xu, Fengjiao Yue, Ting Zhang, Mengran Zhan, Zichang Lu, Yuzhe Ren, Chunsheng Wang, Jing Yin
- 单位
- Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration, Ministry of Education (Northeast Forestry University), Harbin 150040, China; College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; College of Aulin, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2025）
- DOI
- 10.1186/s12934-025-02733-w
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
桦木酸（BA）和齐墩果酸（OA）等三萜类化合物主要依赖植物提取和化学合成，存在效率低、过程复杂、环境污染等问题，亟需开发可持续的微生物合成平台。
研究策略
从171株内生真菌中系统筛选能高效合成BA和OA的菌株，优化培养基和培养条件以提高产量；对高产菌株ZBS49进行全基因组测序和生物信息学分析，解析三萜生物合成途径及关键CYP450基因；并通过体外实验评估BA提取物对肝癌细胞的抑制作用。
核心内容
该研究从171株内生真菌中筛选出两株可高效合成三萜类化合物的丝状真菌ZBS49和XJ1-1，经形态与分子鉴定确认ZBS49属于Clonostachys属。通过优化培养基和发酵条件，ZBS49的桦木酸产量从天然水平的47.7 mg/L提升至288.97 mg/L，较优化前提高506%；XJ1-1的齐墩果酸产量达到86.14 mg/L，提高31%。全基因组测序显示ZBS49基因组大小为57.91 Mb，GC含量49.78%，编码18,358个蛋白，BUSCO完整度99.3%，从中鉴定出16个三萜生物合成相关基因和6个萜烯生物合成基因簇，并在145个CYP450基因中锁定5个与植物C-28氧化酶聚于同一分支的候选基因，为解析桦木酸合成关键氧化步骤提供了靶点。体外实验表明，ZBS49产生的桦木酸提取物对肝癌细胞SMMC-7721和HepG2的IC50均为70 μM，经140 μM处理后两种细胞凋亡率分别从7.58%升至25.9%和从4.9%升至30.1%，呈浓度依赖性。该研究首次在Clonostachys属中系统解析三萜合成途径，证实丝状真菌可作为桦木酸微生物合成的可行平台，为抗肿瘤活性成分的可持续生产提供了新底盘。
创新点
首次鉴定出可高效合成BA和OA的丝状真菌菌株ZBS49和XJ1-1；通过发酵优化使BA产量达到288.97 mg/L（提升506%），OA产量达到86.14 mg/L（提升31%）；首次在Clonostachys属中系统解析三萜生物合成基因簇和预测C-28氧化功能的CYP450基因；发现BA提取物对肝癌细胞具有浓度依赖性抑制作用。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clonostachys sp. ZBS49 | 三萜生物合成（甲羟戊酸途径） | — | 乙酰-CoA C-乙酰转移酶 | 催化 | MVA途径起始酶，共2个乙酰-CoA C-乙酰转移酶 |
| Clonostachys sp. ZBS49 | 三萜生物合成（甲羟戊酸途径） | — | HMG-CoA合酶 | 催化 | MVA途径关键酶 |
| Clonostachys sp. ZBS49 | 三萜生物合成（甲羟戊酸途径） | — | HMG-CoA还原酶 | 催化 | MVA途径限速酶 |
| Clonostachys sp. ZBS49 | 三萜生物合成（甲羟戊酸途径） | — | 角鲨烯合酶 | 催化 | 催化两分子法尼基焦磷酸生成角鲨烯 |
| Clonostachys sp. ZBS49 | 三萜生物合成（甲羟戊酸途径） | — | 角鲨烯单加氧酶 | 催化 | 催化角鲨烯环氧化生成2,3-氧化鲨烯 |
| Clonostachys sp. ZBS49 | 三萜生物合成 | g04998 | 细胞色素P450酶 | 催化 | 预测参与C-28氧化，属于CYP120A家族 |
| Clonostachys sp. ZBS49 | 三萜生物合成 | g08573 | 细胞色素P450酶 | 催化 | 预测参与C-28氧化，属于CYP120A家族 |
| Clonostachys sp. ZBS49 | 三萜生物合成 | g14573 | 细胞色素P450酶 | 催化 | 预测参与C-28氧化，属于CYP120A家族 |
| Clonostachys sp. ZBS49 | 三萜生物合成 | g10613 | 细胞色素P450酶 | 催化 | 预测参与C-28氧化，属于CYP120A家族 |
| Clonostachys sp. ZBS49 | 三萜生物合成 | g14162 | 细胞色素P450酶 | 催化 | 预测参与C-28氧化，属于CYP120A家族 |
| Colletotrichum gloeosporioides XJ1-1 | 三萜生物合成 | — | — | 催化 | 高产齐墩果酸的菌株，天然产量65.76 mg/L，优化后86.14 mg/L |
关键发现
- ZBS49天然产BA
- 7 mg/L，XJ1-1天然产OA
- 76 mg/L；优化后ZBS49的BA产量达288.97 mg/L（较优化前提高506%），XJ1-1的OA产量达86.14 mg/L（提高31%）；ZBS49与Clonostachys sp. ITS序列同源性为99.82%；ZBS49基因组大小为57.91 Mb，GC含量49.78%，含18,358个蛋白编码基因，BUSCO完整度99.3%；基因组中鉴定出16个三萜生物合成相关基因、6个萜烯生物合成基因簇，其中2个为三萜生物合成基因簇；在145个CYP450基因中，5个（g04998、g08573、g14573、g10613、g14162）与植物C-28氧化CYP450基因聚于同一分支；BA提取物对SMMC-7721和HepG2细胞的IC50为70 μM，经70和140 μM处理后凋亡率分别从7.58%升至25.9%（SMMC-7721）和从4.9%升至30.1%（HepG2）；ZBS49发酵第6天DPPH清除率峰值85.55%，XJ1-1在第8天峰值44.01%。
研究结论
研究表明丝状真菌是高效生产桦木酸及其衍生物的可行生物技术平台，ZBS49作为三萜类化合物生物合成的微生物底盘具有重要应用潜力，为癌症治疗提供了理论和实践基础。