Enhanced artemisinin yield by expression of rol genes in Artemisia annua
- 作者
- Erum Dilshad, Rosa Maria Cusido, Javier Palazon, Karla Ramirez Estrada, Mercedes Bonfill, Bushra Mirza
- 单位
- Department of Biochemistry, Faculty of Biological Sciences, Quaid-i-Azam University, Islamabad, Pakistan; Laboratorio de Fisiologia Vegetal, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Barcelona, Spain
- 杂志
- Malaria Journal（2015）
- DOI
- 10.1186/s12936-015-0951-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
青蒿素是治疗疟疾的重要药物，但天然产量不足，难以满足全球需求，需要提高青蒿（Artemisia annua）中青蒿素及其衍生物的含量。
研究策略
以高产青蒿素杂交种Hyb8001r（Zenith）为材料，通过农杆菌介导分别转入rol B和rol C基因，利用LC-MS分析青蒿素及其衍生物含量，并通过实时荧光定量PCR分析青蒿素生物合成关键基因（ADS、CYP71AV1、ALDH1）和毛状体发育相关基因TAFR1的表达，同时测定毛状体密度。
核心内容
该研究以高产青蒿素杂交种Hyb8001r为材料，通过农杆菌介导分别转入rol B和rol C基因，旨在提高青蒿中青蒿素及其衍生物的积累。利用LC-MS测定代谢物含量，结合实时荧光定量PCR分析青蒿素合成关键基因（ADS、CYP71AV1、ALDH1）和毛状体发育基因TAFR1的表达，并统计毛状体密度。结果显示，rol B转基因株系中青蒿素含量提高2.7至9.2倍，青蒿酯提高4至12.6倍；rol C株系中青蒿素提高4至4.6倍，青蒿酯提高4.4至9.1倍。rol B对青蒿素合成的促进作用更强，且两种rol基因均显著上调CYP71AV1（最高达20.9倍）、ALDH1和ADS表达，同时提高TAFR1转录水平。转基因植株毛状体密度达20至30个/平方厘米，远高于野生型的5至7个/平方厘米。该工作首次分别验证了rol B和rol C在青蒿中的独立增效作用，从分子水平揭示了其通过激活合成途径基因和促进毛状体发育来提升青蒿素产量的机制，为青蒿素高产育种提供了有效策略。
创新点
首次分别单独表达rol B和rol C基因于青蒿中，证明二者均可显著提高青蒿素及衍生物含量，且rol B效果优于rol C；从分子水平阐明了rol基因对青蒿素合成途径基因和毛状体发育的正向调控作用。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua (Hyb8001r) | 次级代谢调控 | rol B | Rol B protein | 调控 | 具有酪氨酸磷酸酶活性，调节生长素信号通路，增强次级代谢产物合成 |
| Artemisia annua (Hyb8001r) | 次级代谢调控 | rol C | Rol C protein | 调控 | 具有细胞分裂素葡萄糖苷酶活性，影响激素平衡，提高次生代谢物含量 |
| Artemisia annua (Hyb8001r) | 青蒿素生物合成途径 | ADS | Amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 催化法尼基二磷酸（FDP）转化为紫穗槐二烯，是青蒿素生物合成的关键酶 |
| Artemisia annua (Hyb8001r) | 青蒿素生物合成途径 | CYP71AV1 | Cytochrome P450 monooxygenase | 催化 | 催化紫穗槐二烯氧化为青蒿酸前体，是青蒿素合成的限速酶之一 |
| Artemisia annua (Hyb8001r) | 青蒿素生物合成途径 | ALDH1 | Aldehyde dehydrogenase 1 | 催化 | 催化青蒿醛氧化为青蒿酸，参与青蒿素合成的后期步骤 |
| Artemisia annua (Hyb8001r) | 青蒿素生物合成途径/毛状体发育 | TAFR1 | Trichome-specific fatty acyl-CoA reductase 1 | 催化 | 参与毛状体发育和倍半萜生物合成，其表达与青蒿素积累相关 |
关键发现
- rol B转基因植株中青蒿素含量提高2.7-9.2倍，青蒿酯提高4-12.6倍，双氢青蒿素提高1.2-3倍
- rol C转基因植株中青蒿素提高4-4.6倍，青蒿酯提高4.4-9.1倍，双氢青蒿素提高1.5-2倍。青蒿素合成基因表达分析显示：rol B转化株中CYP71AV1表达提高8-20.9倍，ALDH1提高8-10倍，ADS提高5.9-8.5倍
- rol C转化株中CYP71AV1提高6-15.5倍，ALDH1提高6.4-9.5倍，ADS提高5-7.5倍。TAFR1表达在rol B株中提高2.3-3倍，rol C株中提高1.6-2倍。转基因植株毛状体密度为20-30个/cm²，野生型仅为5-7个/cm²。
研究结论
rol B和rol C基因能有效提高青蒿中青蒿素及其衍生物的积累，rol B基因的促进作用更强；转基因植株中rol基因表达水平与青蒿素积累呈正相关，并伴随青蒿素生物合成途径基因和毛状体发育基因表达的上调。