Large-scale robot-assisted genome shuffling yields industrial Saccharomyces cerevisiae yeasts with increased ethanol tolerance
- 作者
- Tim Snoek, Martina Picca Nicolino, Stefanie Van den Bremt, Stijn Mertens, Veerle Saels, Alex Verplaetse, Jan Steensels, Kevin J Verstrepen
- 单位
- Laboratory for Genetics and Genomics, Centre of Microbial and Plant Genetics (CMPG), KU Leuven, Kasteelpark Arenberg 22, 3001 Leuven, Belgium; Laboratory for Systems Biology, VIB, Bio-Incubator, Gaston Geenslaan 1, 3001 Leuven, Belgium; Laboratory of Enzyme, Fermentation and Brewing Technology, KU Leuven technologiecampus Ghent, Gebroeders De Smetstraat 1, 9000 Ghent, Belgium
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2015）
- DOI
- 10.1186/s13068-015-0216-0
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高工业酿酒酵母在超高浓度（VHG）发酵条件下的乙醇耐受性，以避免高浓度乙醇导致的发酵停滞或减缓，从而增加乙醇产量和效率。
研究策略
从318株不同来源的酿酒酵母中筛选出8株遗传多样且产孢能力好的亲本菌株，采用两种大规模基因组改组策略（随机交配和机器人辅助的靶向交配），结合多种选择方法（生长筛选、存活筛选、无选择）进行多轮杂交，最终筛选获得乙醇耐受性和发酵性能优于商业菌株Ethanol Red的新型杂交株。
核心内容
该研究针对超高浓度乙醇发酵中工业酿酒酵母耐受性不足的问题，从318株菌株中筛选出8株遗传多样的亲本，开展大规模基因组改组。研究同时采用随机交配与机器人辅助靶向交配两种策略，并结合生长筛选、存活筛选和无选择三种方法进行多轮杂交。结果显示，随机改组中F2和F3代分别有29/72和21/72的克隆表现出乙醇耐受性杂种优势，而存活筛选极为严格，F1代经18%乙醇暴露后存活率仅约0.003%。在135个测试杂交种中，8株（H1–H8）的最大乙醇积累比商业菌株Ethanol Red提高2–7%，其中最佳菌株H1在8升中试中利用32%葡萄糖发酵，乙醇产量达18.7%（v/v），产率为0.90 g/L/h。值得注意的是，F1代平均表现优于F3代，挑战了多轮改组必然更优的假设。该工作证明利用自然遗传多样性与高通量杂交技术能有效改良酵母复杂工业性状，且最佳菌株具备良好的产业化前景。
创新点
['利用多个天然遗传多样的亲本菌株而非单一诱变株进行基因组改组，充分利用自然遗传变异', '采用机器人辅助的高通量筛选和杂交技术，实现了超过3000个靶向杂交的大规模操作', '比较了随机交配和靶向交配两种策略，以及生长选择、存活选择和无选择三种筛选方法对最终杂合子性能的影响', '发现F1代杂合子在VHG发酵中平均表现优于F3代，挑战了多轮改组必然更好的假设', '筛选出8个杂交株在最大乙醇积累上比商业菌株Ethanol Red提高2-7%，其中最佳杂交株H1在中试规模的发酵中展现出优异的工业化潜力']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae Ethanol Red (P7) | 乙醇发酵 | — | — | 催化 | 商业生物乙醇菌株，作为亲本和对照，在VHG发酵中产乙醇参考基准 |
| Saccharomyces cerevisiae 其他亲本菌株 P1-P6, P8 | 乙醇发酵 | — | — | 催化 | 七株遗传多样的亲本菌株，提供天然遗传变异用于基因组改组 |
| Saccharomyces cerevisiae 杂交种 H1 | 乙醇发酵 | — | — | 催化 | 最佳杂交种，8L中试发酵中产乙醇18.7%(v/v)，产率0.90 g/L/h，得率0.45 g/g |
关键发现
- 研究筛选了318株酿酒酵母，选出8株遗传多样的亲本菌株（含商业菌株Ethanol Red）。随机基因组改组中，F2和F3代分别有29/72和21/72的克隆对乙醇耐受性表现出杂种优势
- 存活筛选极具选择性，F1代经18%(v/v)乙醇暴露后仅约0.003%的细胞存活（10^9中约30,000个）。靶向改组中，F1杂交种的乙醇耐受性显著高于近交种，且多数F1杂交种表现出杂种优势。在135个测试的F1和F3杂交种中，8个杂交种（H1-H8）的最大乙醇积累比Ethanol Red显著提高2-7%
- 其中H1在8L中试中利用32%(w/v)葡萄糖发酵，最大乙醇产量达18.7%(v/v)，产率0.90 g乙醇/L/h，得率0.45 g乙醇/g葡萄糖。另外，H1-H7的乙醇产量相对Ethanol Red为103.9%-107.3%，且产量统计显著更高。生长在11%(v/v)乙醇中的能力与乙醇产量呈显著正相关（Pearson r=0.51, P<0.0001）。
研究结论
该研究表明，通过大规模基因组改组（包括随机和靶向策略）可以有效筛选出乙醇耐受性和发酵性能显著提高的酿酒酵母杂交株。相较于商业菌株Ethanol Red，多个杂交株在VHG发酵中表现出更高的乙醇积累，其中最佳菌株在中试规模发酵中展现出优异的工业化应用潜力。研究还发现F1代杂交种往往优于F3代，提示多轮改组并非总是必要。这些结果证明利用自然遗传多样性和高通量杂交技术是改良工业酵母复杂性状的有效途径。