Pamoic acid and carbenoxolone specifically inhibit CRISPR/Cas9 in bacteria, mammalian cells, and mice in a DNA topology-specific manner
- 作者
- Yuxuan Zhang, Wentao Zou, Yueyang Zhou, Jiaqi Chen, Youtian Hu, Fang Wu
- 单位
- Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Shanghai Center for Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
- 杂志
- Genome Biology（2025）
- DOI
- 10.1186/s13059-025-03521-w
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏能够调控CRISPR/Cas9活性的特异性小分子抑制剂，尤其缺乏具有DNA拓扑选择性的抑制剂，难以控制Cas9的基因编辑活性及其脱靶效应
研究策略
高通量筛选4607种FDA/FAD批准药物，通过体外纯化酶活性实验鉴定Cas9抑制剂，结合生化分析、细菌、哺乳动物细胞和小鼠模型验证效果与机制
核心内容
研究人员从4607种FDA/FAD批准药物中高通量筛选CRISPR/Cas9小分子抑制剂，通过体外纯化酶活性实验鉴定出31个剂量依赖性抑制SpyCas9的化合物，其中pamoic acid、dalbavancin、carbenoxolone和epirubicin在体外、细菌、哺乳动物细胞和小鼠模型中均表现出有效抑制活性，分属三种不同抑制机制。生化分析揭示pamoic acid和carbenoxolone是DNA拓扑选择性抑制剂，对线性DNA切割的IC50分别为10-20 μM和5-10 μM，而对质粒DNA的IC50约600 μM和100 μM，二者与Cas9的结合KD为12.8-56.4 μM。epirubicin对质粒切割的IC50为2-5 μM。在HEK293FT细胞中，三种抑制剂抑制GFP破坏的IC50在10-50 μM范围内；在细菌SSEA基因编辑实验中，epirubicin、dalbavancin、carbenoxolone和pamoic acid的IC50分别约为6.25、12.5、100和400 μM。小鼠PCSK9模型中，pamoic acid在80或160 mg/kg剂量下完全恢复PCSK9水平并呈剂量依赖性。这项工作提供了可调控Cas9活性的特异性化学工具，其中拓扑选择性抑制剂为控制基因编辑活性及降低脱靶效应开辟了新途径。
创新点
1. 发现四种新的Cas9小分子抑制剂（pamoic acid, dalbavancin, carbenoxolone, epirubicin），分属三种抑制机制；2. 揭示pamoic acid和carbenoxolone是DNA拓扑选择性抑制剂，优先抑制线性DNA切割；3. 证明pamoic acid在体内小鼠模型中有效抑制Cas9介导的基因编辑
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655 | CRISPR/Cas9基因组编辑 | SpyCas9 | Streptococcus pyogenes Cas9 | 催化 | II-A型Cas9内切酶，作为主要抑制靶点 |
| Escherichia coli MG1655 | CRISPR/Cas9基因组编辑 | SauCas9 | Staphylococcus aureus Cas9 | 催化 | 同源Cas9，也受抑制剂影响 |
| HEK293FT | CRISPR/Cas9基因组编辑 | SpyCas9 | SpyCas9 | 催化 | 哺乳动物细胞中的基因编辑 |
| HEK293FT | 碱基编辑 | BE4 | BE4胞嘧啶碱基编辑器 | 催化 | SpyCas9切口酶与脱氨酶融合，进行C-to-T编辑 |
| 小鼠（水动力注射模型） | PCSK9信号通路 | PCSK9 | PCSK9 | 调控 | Cas9编辑的靶基因，其血浆水平被下调约50% |
| 无细胞体系 | CRISPR/Cas9 | dCas9 | dCas9（催化失活Cas9） | 调控 | 用于结合实验，验证抑制剂对DNA结合的影响 |
| 无细胞体系 | CRISPR/Cas9抑制 | AcrIIA4 | AcrIIA4 (anti-CRISPR蛋白) | 调控 | 已知Cas9抑制剂，作为对照 |
关键发现
- 从4607个化合物中筛出31个剂量依赖性抑制SpyCas9的化合物，其中pamoic acid、dalbavancin、carbenoxolone和epirubicin在体外、细菌、哺乳动物细胞和小鼠中均有效。epirubicin对SpyCas9质粒切割的IC50为2-5 μM，dalbavancin为10-20 μM
- pamoic acid对线性DNA的IC50为10-20 μM（对质粒约600 μM），carbenoxolone对线性DNA的IC50为5-10 μM（对质粒约100 μM）。在细菌SSEA基因编辑实验中，epirubicin IC50约6.25 μM，dalbavancin约12.5 μM，carbenoxolone约100 μM，pamoic acid约400 μM。在HEK293FT细胞中，pamoic acid、dalbavancin和carbenoxolone抑制GFP破坏的IC50分别为20-50 μM、10-20 μM和10-20 μM。在小鼠PCSK9模型中，pamoic acid在80或160 mg/kg剂量下完全恢复PCSK9水平，从20 mg/kg起呈剂量依赖性。pamoic acid和carbenoxolone与Cas9结合的KD为12.8-56.4 μM。
研究结论
本研究鉴定出四种可调控Cas9活性的特异性小分子抑制剂，其中pamoic acid和carbenoxolone具有DNA拓扑选择性，优先抑制线性DNA，可用于控制Cas9的切割活性，为基因编辑的安全调控提供新工具