Engineering Geobacillus thermoglucosidasius for direct utilisation of holocellulose from wheat straw
- 作者
- Zeenat Bashir, Lili Sheng, Annamma Anil, Arvind Lali, Nigel P. Minton, Ying Zhang
- 单位
- Clostridia Research Group, BBSRC/EPSRC Synthetic Biology Research Centre (SBRC), School of Life Sciences, University of Nottingham, University Park, Nottingham NG7 2RD, UK; DBT-ICT Centre for Energy Biosciences, Institute of Chemical Technology, Nathalal Parikh Marg, Mumbai 400019, India
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2019）
- DOI
- 10.1186/s13068-019-1540-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决非纤维素分解菌Geobacillus thermoglucosidasius无法直接利用未添加水解酶的木质纤维素生物质（如预处理小麦秸秆）的问题，实现一步式整合生物加工（CBP）生产纤维素乙醇。
研究策略
在G. thermoglucosidasius中异源表达并分泌来自不同嗜热菌的糖苷水解酶（内切葡聚糖酶CtCelA/CbCelA、外切葡聚糖酶Cel6B及β-葡萄糖苷酶CglT），将cglT基因整合至染色体以增强纤维二糖利用，并在质粒上共表达纤维素酶基因，构建能直接降解预处理小麦秸秆的重组菌株；随后将该酶系统引入产乙醇菌株LS242，实现纤维素乙醇的一步法生产。
核心内容
本研究通过在嗜热菌Geobacillus thermoglucosidasius中异源表达并分泌多种嗜热糖苷水解酶，实现了对未添加水解酶的预处理小麦秸秆的直接利用和纤维素乙醇的一步式生产。研究者分别表达了来自不同嗜热菌的内切葡聚糖酶CtCelA、外切葡聚糖酶Cel6B以及多功能纤维素酶CbCelA，并将β-葡萄糖苷酶基因cglT整合至染色体以增强纤维二糖利用。酶活测定显示CtCelA的内切葡聚糖酶比活力为15.6 μmol min⁻¹ mg⁻¹，CbCelA对CMC的比活力为0.735 μmol min⁻¹ mg⁻¹。整合cglT的菌株在10小时内完全消耗30 g/L纤维二糖，而野生型仅消耗45%。在含85.15%纤维素的预处理小麦秸秆上，共表达多种纤维素酶的菌株BZ9和BZ12的CFU较单一酶表达菌株提高2至3倍。进一步将酶系统引入产乙醇菌株后，BZ243和BZ244在24小时的乙醇产量分别达4.2 mM和3.7 mM，较对照提高约2倍和1.6倍。该工作首次证明该嗜热菌可作为整合生物加工平台直接降解木质纤维素生物质并生产乙醇，为可持续生物燃料开发提供了新途径。
创新点
首次在嗜热菌Geobacillus thermoglucosidasius中实现来自Caldicellulosiruptor bescii的多功能纤维素酶CbCelA的异源分泌表达（属首次之一）；构建了含合成纤维小体操纵子（CtCelA+Cel6B）的重组菌株；通过染色体整合β-葡萄糖苷酶cglT显著增强纤维二糖利用；首次实现G. thermoglucosidasius直接以未加酶的预处理小麦秸秆为底物进行乙醇生产。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Geobacillus thermoglucosidasius NCIMB 11955 | 纤维二糖利用 | cglT | CglT (β-1,4-葡萄糖苷酶) | 催化 | 来自Thermoanaerobacter brockii，通过ACE整合至pyrE位点，组成型表达，增强纤维二糖水解为葡萄糖 |
| Geobacillus thermoglucosidasius BZ9 | 纤维素降解 | CbcelA | CbCelA (多功能纤维素酶，含GH9和GH48催化域) | 催化 | 来自Caldicellulosiruptor bescii，由质粒pMTLgSlimS-CbcelA表达，兼具内切和外切葡聚糖酶活性 |
| Geobacillus thermoglucosidasius BZ10 | 纤维素降解 | CtcelA-cel6B | CtCelA (内切葡聚糖酶) 和 Cel6B (外切葡聚糖酶) | 催化 | 来自Clostridium thermocellum和Thermobifida fusca，构建成合成纤维小体操纵子于质粒上共表达 |
| Geobacillus thermoglucosidasius BZ243 | 纤维素乙醇生产 | CbcelA, cglT | CbCelA, CglT | 催化 | 在产乙醇菌株LS242（Δldh, Δpfl, pdh^up）中整合cglT并表达CbcelA，实现一步法纤维素乙醇生产 |
| Geobacillus thermoglucosidasius BZ244 | 纤维素乙醇生产 | CtcelA, cel6B, cglT | CtCelA, Cel6B, CglT | 催化 | 在产乙醇菌株LS242基础上整合cglT并共表达CtcelA和cel6B，实现一步法纤维素乙醇生产 |
关键发现
- 成功表达并分泌异源糖苷水解酶：CtCelA的内切葡聚糖酶比活力为15.6±1 μmol min⁻¹ mg⁻¹
- Cel6B的外切葡聚糖酶比活力为0.0135±0.003 μmol min⁻¹ mg⁻¹
- CbCelA对CMC和RAC的比活力分别为0.735±0.07和0.0831±0.006 μmol min⁻¹ mg⁻¹。整合cglT的ZB3bInt菌株在10 h内完全消耗30 g/L纤维二糖，而野生型仅消耗45±0.02%。在预处理小麦秸秆（含85.15%纤维素、4.35%木糖）上，BZ9和BZ10菌株在12 h的CFU分别比仅表达单一酶的菌株高2倍和3倍，且生长显著优于野生型。在产乙醇菌株基础上构建的BZ243和BZ244在24 h乙醇产量分别为4.2 mM和3.7 mM，较LS242（2 mM）提高约2倍和1.6倍。
研究结论
通过异源表达糖苷水解酶，工程化G. thermoglucosidasius能够直接利用未经酶解的预处理小麦秸秆进行生长并生产乙醇，证明了该菌株作为纤维素降解和整合生物加工（CBP）平台的潜力，为可持续生物燃料生产提供了新途径。