Genome shuffling enhances stress tolerance of Zymomonas mobilis to two inhibitors
- 作者
- Weiting Wang, Bo Wu, Han Qin, Panting Liu, Yao Qin, Guowei Duan, Guoquan Hu, Mingxiong He
- 单位
- Biomass Energy Technology Research Centre, Key Laboratory of Development and Application of Rural Renewable Energy (Ministry of Agriculture and Rural Affairs), Biogas Institute of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Section 4-13, Renmin Rd. South, Chengdu 610041, People's Republic of China; Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100081, People's Republic of China; College of Pharmacy and Biological Engineering, Chengdu University, Chengdu 610041, People's Republic of China
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2019）
- DOI
- 10.1186/s13068-019-1631-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
木质纤维素预处理和水解过程中产生的糠醛和乙酸会严重抑制运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）的生长、代谢和乙醇发酵效率，需要开发高效的方法提高其对这两种抑制剂的联合耐受性。
研究策略
采用原生质体电融合介导的基因组改组技术，以乙酸耐受菌株AQ8-1和糠醛耐受菌株F34为亲本，经过两轮基因组改组和筛选，获得兼具两种抑制剂耐受性的重组菌株，并通过全基因组重测序分析遗传变化。
核心内容
本研究以乙酸耐受菌株AQ8-1和糠醛耐受菌株F34为亲本，通过原生质体电融合介导的基因组改组技术，经两轮改组与筛选，获得10株可同时耐受5.0 g/L乙酸和3.0 g/L糠醛的运动发酵单胞菌突变株。其中菌株532和533表现最优，在7.0 g/L乙酸条件下发酵时间缩短至30 h，乙醇生产率为0.77和0.76 g/L/h，显著高于亲本AQ8-1的0.55 g/L/h和野生型ZM4的0.38 g/L/h。在5.0 g/L乙酸与3.0 g/L糠醛联合胁迫下，二者培养42 h葡萄糖消耗率达97.8%，而亲本仅消耗40.9%，野生型仅20.8%，乙醇生产率较亲本提高88.5%。全基因组重测序在10株突变株中鉴定出19个共同SNV和11个indel，其中多数源自亲本基因重组，少量为从头突变，涉及谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶、DNA修复蛋白RadA及ABC转运蛋白等基因。结果表明基因组改组能有效提升运动发酵单胞菌对双抑制剂的联合耐受性，所得菌株可作为纤维素乙醇生产的潜在底盘，相关突变位点也为解析细菌抑制剂胁迫响应机制提供了线索。
创新点
首次将原生质体电融合基因组改组应用于运动发酵单胞菌双抑制剂耐受性改良；通过两轮改组获得10株可耐受5.0 g/L乙酸和3.0 g/L糠醛的突变株；全基因组重测序揭示了突变来源于亲本基因重组和从头突变。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Zymomonas mobilis | 有机酸胁迫响应 | ZMO_RS00235 | glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase | 催化 | 所有10株改组菌均携带SNV，来源于亲本AQ8-1，与有机酸胁迫耐受相关 |
| Zymomonas mobilis | DNA修复 | ZMO_RS02620 | DNA repair protein RadA | 催化 | 所有10株改组菌均携带SNV，来源于亲本AQ8-1，酸胁迫下DNA修复至关重要 |
| Zymomonas mobilis | 精氨酸生物合成 | ZMO_RS03765 | arginine-tRNA ligase | 催化 | 所有10株改组菌均携带SNV（1个非同义+1个同义），来源于亲本F34 |
| Zymomonas mobilis | 转座 | ZMO_RS09165 | IS5/IS1182 family transposase | 催化 | 所有10株改组菌均携带2个SNV，来源于F34或新突变 |
| Zymomonas mobilis | 糠醛胁迫响应 | ZMO_RS04405 | ABC transporter substrate-binding protein | 转运 | 10株中部分存在2个单核苷酸缺失导致移码，与糠醛转运外排相关 |
| Zymomonas mobilis | 精氨酸生物合成 | ZMO_RS07255 | carbamoyl phosphate synthase large subunit | 催化 | 存在-7bp缺失，可能参与酸胁迫下的精氨酸合成 |
| Zymomonas mobilis | 未知 | ZMO_RS09180 | hypothetical protein | — | 存在5种独立的缺失（-40,-32,-24,-16,-8 bp），功能未知 |
| Zymomonas mobilis | 细胞壁合成 | ZMO_RS04290 | monofunctional biosynthetic peptidoglycan transglycosylase | 催化 | 基因间区SNV位于其与细胞色素c基因之间，维持细胞壁完整性 |
| Zymomonas mobilis | 电子传递 | ZMO_RS04295 | cytochrome c | 能量供给 | 基因间区SNV可能影响其表达，参与能量代谢 |
| Zymomonas mobilis | 膜转运 | ZMO_RS06410 | FUSC family protein | 转运 | 其与DNA聚合酶III亚基δ之间区域存在-1bp缺失（所有10株） |
| Zymomonas mobilis | 细胞表面黏附 | ZMO_RS01090 | Bap domain-containing protein | — | 5个菌株发生染色体内部迁移涉及该基因 |
关键发现
- 两轮基因组改组后获得10株在5.0 g/L乙酸和3.0 g/L糠醛存在下生长和乙醇产量提高的突变株。最突出的菌株532和533在7.0 g/L乙酸条件下发酵时间缩短至30 h，乙醇产率分别为0.463和0.456 g/g葡萄糖，生产率为0.77和0.76 g/L/h，显著高于亲本AQ8-1（0.55 g/L/h）和野生型ZM4（0.38 g/L/h）。在5.0 g/L乙酸+3.0 g/L糠醛联合胁迫下，532和533培养42 h葡萄糖消耗率达97.8%，而亲本AQ8-1和F34仅消耗40.9%，ZM4仅20.8%
- 乙醇生产率分别为0.50和0.51 g/L/h，比亲本高88.5%，比野生型高130.5%。在3.0 g/L糠醛单独胁迫下，533与亲本F34表现无显著差异，乙醇生产率均为0.63 g/L/h。全基因组重测序在10株突变株中发现19个共同的SNV和11个indel，其中18个SNV来自亲本，5个indel可能来自亲本，其余为从头突变
- 基因ZMO_RS00235（谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶）、ZMO_RS02620（DNA修复蛋白RadA）、ZMO_RS04405（ABC转运蛋白底物结合蛋白）等可能与抑制剂耐受相关。
研究结论
基因组改组是增强运动发酵单胞菌对乙酸和糠醛双抑制剂耐受性的有效方法，获得的突变株可作为潜在的纤维素乙醇生产菌株，并有助于理解细菌的胁迫响应与调控机制。