The stereochemical course of 2-methylisoborneol biosynthesis
- 作者
- Binbin Gu, Anwei Hou, Jeroen S. Dickschat
- 单位
- Kekule-Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, University of Bonn, Gerhard-Domagk-Straße 1, 53121 Bonn, Germany
- 杂志
- Beilstein Journal of Organic Chemistry（2022）
- DOI
- 10.3762/bjoc.18.82
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
确定2-甲基异冰片（2-methylisoborneol）生物合成中真正的立体化学途径中间体，究竟是(R)-2-甲基烯丙基二磷酸（(R)-2-Me-LPP）还是(S)-2-Me-LPP。
研究策略
以Sharpless环氧化为关键步骤对映选择性合成(R)-和(S)-2-Me-LPP，并通过手性固定相HPLC分离获得高对映体纯度底物，随后用2-甲基异冰片合酶（2MIBS）进行体外酶促转化，通过GC/MS分析产物来确定真正的途径中间体。
核心内容
本研究通过对映选择性合成与手性HPLC分离，首次获得对映体纯度超过99% ee的(R)-和(S)-2-甲基烯丙基二磷酸（2-Me-LPP）两种底物，并利用2-甲基异冰片合酶（2MIBS）进行体外酶促转化，以GC/MS分析产物，从而确定2-甲基异冰片生物合成中真正的立体化学途径中间体。结果显示，从(R)-2-Me-LPP与2MIBS孵育得到主要产物2-甲基异冰片，占总酶产物75%，副产物包括2-亚甲基莰烷（13%）、2-甲基芳樟醇（8%）等；而(S)-2-Me-LPP主要生成2-甲基-α-萜品醇（55%），仅产生少量目标产物。无酶对照实验进一步排除了非酶转化的干扰。实验证实(R)-2-Me-LPP是途径中的on-pathway中间体，而(S)-2-Me-LPP可通过异构化为2-Me-GPP再转化为(R)-2-Me-LPP。该结果支持Cane提出的立体化学机制，并提示晶体结构中的2-氟-GPP构象可能不代表产生2-甲基异冰片所需构象，为理解该萜类天然产物的生物合成机制提供了关键实验证据。
创新点
首次通过手性HPLC获得对映体纯度>99% ee的2-Me-LPP对映体；首次实验证明(R)-2-Me-LPP是2-甲基异冰片生物合成的真正中间体，并解释(S)-2-Me-LPP经异构化生成产物的机制。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| — | 2-甲基异冰片生物合成途径 | — | 2-methylisoborneol synthase (2MIBS) | 催化 | 催化2-Me-LPP环化生成2-甲基异冰片及其副产物 |
关键发现
- 从(R)-2-Me-LPP与2MIBS孵育得到主要产物2-甲基异冰片(1)，产率占总酶产物75%，副产物包括2-亚甲基莰烷(10, 13%)、2-甲基芳樟醇(6, 8%)、2-亚甲基葑烷(12, 2%)、2-甲基-2-莰烯(11, 1%)、2-甲基-α-萜品醇(9, 1%)、2-甲基月桂烯(7, 1%)
- (S)-2-Me-LPP则主要生成9(55%)，仅少量1与6共洗脱(合计15%)，副产物10(13%), 8(13%), 12(2%), 7(1%)
- 无酶对照中9(70%)、6(22%)、7(5%)、8(1%)
- 手性HPLC纯化后两种对映体ee均>99%，且二磷酸化去磷酸化后仍保持>99% ee。证明(R)-2-Me-LPP是on-pathway中间体，而(S)-2-Me-LPP可通过异构化为2-Me-GPP再转化为(R)-2-Me-LPP。
研究结论
实验证实(R)-2-Me-LPP是2-甲基异冰片生物合成途径中的真正中间体，支持Cane提出的立体化学机制；晶体结构中的2-氟-GPP构象可能不代表2-Me-GPP产生1所需构象。