Evolutionary engineering of E. coli MG1655 for tolerance against isoprenol
- 作者
- Heiko Babel, Jens O. Kromer
- 单位
- Helmholtz Centre for Environmental Research-UFZ, Leipzig, Germany; Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Biberach, Germany
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2020）
- DOI
- 10.1186/s13068-020-01825-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
异戊烯醇（isoprenol）对大肠杆菌的毒性限制了其微生物生产，需要提高菌株对异戊烯醇的耐受性以实现高效生物合成。
研究策略
利用适应性实验室进化（ALE）对大肠杆菌MG1655进行异戊烯醇耐受性进化，结合全基因组重测序和RNA-seq鉴定关键突变，并通过基因敲除和过表达回补验证突变对耐受性的贡献。
核心内容
本研究通过适应性实验室进化（ALE）对大肠杆菌MG1655进行约200代连续培养，成功获得对异戊烯醇高耐受的进化菌株。在50 mM异戊烯醇胁迫下，进化菌株生长速率较亲本提高最多47%，并能在80 mM（6.8 g/L）异戊烯醇浓度下生长，而亲本完全无法存活。结合全基因组重测序和RNA-seq分析，鉴定出fabF、marC、yghB和rob四个关键靶基因突变：yghB上游15 bp缺失导致其表达上调14倍，rob基因发生截短突变（H48→移码），这些突变通过基因敲除和过表达回补实验得到功能验证。进一步实验表明，敲除marC或表达突变型Rob不仅能增强异戊烯醇耐受性，还对丁醇和香兰素产生交叉保护作用；而yghB敲除虽降低异戊烯醇耐受性，却使香兰素耐受性提高约20%。RNA-seq还发现rraA表达下调约2^-14倍。该研究首次系统揭示了异戊烯醇耐受性的遗传基础，所鉴定的靶基因及其交叉保护效应为菌株工程改造和异戊烯醇等生物燃料的高效微生物生产提供了新的优化策略。
创新点
首次通过ALE获得对异戊烯醇耐受的大肠杆菌菌株，鉴定出fabF、marC、yghB和rob四个关键靶基因；揭示了yghB启动子缺失导致其过表达，以及Rob蛋白的截短突变赋予耐受性；并证明这些突变对其他醇类和醛类化合物也有交叉保护作用。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655 | 脂肪酸生物合成 | fabF | FabF (3-oxoacyl-ACP synthase II) | 催化 | 突变F74C，与丁醇耐受相关，改变膜脂肪酸组成 |
| Escherichia coli MG1655 | 膜蛋白 | marC | MarC（内膜蛋白） | 转运 | 敲除提高异戊烯醇和丁醇耐受性；突变M35→stop导致功能缺失 |
| Escherichia coli MG1655 | 膜蛋白 | yghB | YghB（DedA家族膜蛋白） | 转运 | 上游15 bp缺失导致其过表达（14倍）；敲除降低异戊烯醇耐受性，但提高香兰素耐受性约20% |
| Escherichia coli MG1655 | 应激响应调控 | rob | Rob（转录调控因子） | 调控 | 突变H48→frameshift等；突变型Rob蛋白表达提高异戊烯醇和香兰素耐受性，但敲除无益 |
| Escherichia coli MG1655 | 甲醛解毒 | frmR | FrmR（甲醛阻遏物） | 调控 | 突变与商业异戊烯醇中甲醛杂质有关 |
| Escherichia coli MG1655 | 脂肪酸生物合成 | plsX | PlsX（脂肪酸/磷脂合成蛋白） | 催化 | 两个突变（Q274→STOP和G291C），与异丁醇耐受性相关 |
| Escherichia coli MG1655 | RNA代谢 | rraA | RraA（核糖核酸酶E抑制剂） | 调控 | 突变V96→E和G67→S，在进化后期不稳定；RNA-seq显示其下调最强（约2^-14倍） |
关键发现
- 通过ALE进化约200代，成功获得对异戊烯醇耐受的大肠杆菌菌株。在50 mM异戊烯醇下，生长速率较亲本提高最多47%
- 能够生长在80 mM（6.8 g/L）异戊烯醇，而亲本在此浓度下无法生长。鉴定出4个主要靶基因（fabF、marC、yghB、rob），其中yghB上游15 bp缺失导致其表达上调14倍
- 敲除marC和表达突变型Rob（H48→frameshift）均可提高异戊烯醇和丁醇耐受性
- yghB敲除则降低异戊烯醇耐受性，但提高香兰素耐受性约20%。RNA-seq显示rraA表达下调最多（约2^-14倍）。这些突变对丁醇和香兰素也有交叉保护作用。
研究结论
通过适应性实验室进化成功提高了大肠杆菌对异戊烯醇的耐受性，鉴定出fabF、marC、yghB和rob四个关键基因突变，并通过回补实验验证其功能。这些突变不仅提高异戊烯醇耐受性，对丁醇和香兰素也有交叉保护作用，为优化异戊烯醇及其他生物燃料的生产提供了新的靶点。