高级醇 · 代谢工程文献库

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Synechococcus elongatus as a model of photosynthetic bioreactor for expression of recombinant β-glucosidases

作者
Raíza Azevedo, Jéssika Lawall Lopes, Manuel Macedo de Souza, Betania Ferraz Quirino, Letícia Jungmann Cançado, Luis Fernando Marins
单位
Laboratory of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences (ICB), Federal University of Rio Grande (FURG), Av. Italia, Km 8, Rio Grande, RS 96203-900, Brazil; Institute of Oceanography (IO), Federal University of Rio Grande (FURG), Av. Italia, Km 8, Rio Grande, RS 96203-900, Brazil; Embrapa-Agroenergy, Parque Estacao Biologica, s/n, Brasilia, DF 70770-901, Brazil
杂志
Biotechnology for Biofuels（2019）
DOI
10.1186/s13068-019-1505-9
所属领域
代谢工程
关键词
CellulasesCyanobacteriaGenetic engineeringHeterologous expressionpET system
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解决的核心问题

利用蓝藻作为光合生物反应器生产重组β-葡萄糖苷酶，以降低第二代乙醇生产中的酶成本，同时利用第一代乙醇工业的副产物（CO2和酒糟）实现可持续生产。

研究策略

将pET表达系统整合到Synechococcus elongatus PCC 7942基因组中：T7 RNA聚合酶基因受镍诱导启动子PnrsB控制，目标β-葡萄糖苷酶基因AMBGL17受T7启动子控制，通过镍诱导实现异源酶的高水平表达。

研究路线图

100%
核心问题：利用蓝藻光合反应器低成本生产β-葡萄糖苷酶
策略：整合pET表达系统到蓝藻基因组
改造1：PnrsB镍诱导启动子控制T7RNAP
改造2：T7启动子控制AMBGL17基因表达
改造3：双基因整合至PCC 7942染色体
结果：镍诱导后T7RNAP增5.5倍，AMBGL17增22倍，酶活最高7.4倍
结论：蓝藻可作为β-葡萄糖苷酶生产平台，整合1G/2G乙醇实现低成本环保生产
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核心内容

本研究将pET表达系统引入蓝藻Synechococcus elongatus PCC 7942，构建了双转基因菌株用于生产重组β-葡萄糖苷酶AMBGL17。系统中T7 RNA聚合酶受镍诱导启动子PnrsB控制，目标酶基因则置于T7启动子下游，通过添加NiSO4实现异源酶的高效诱导表达。实验结果表明，镍诱导后T7RNAP表达上升约5.5倍，AMBGL17基因表达上调22倍；β-葡萄糖苷酶活性在诱导后6小时、18小时和24小时分别较野生型提高1.7倍、7.4倍和3.5倍。该酶的动力学参数优良，Km为0.30 mM，Kcat/Km达128.56 s⁻¹ mM⁻¹。研究还发现5 μM NiSO4在延滞期对菌株有毒性，但在稳定期无显著影响，且外源基因整合不改变菌株正常生长。这项工作首次在蓝藻中实现了重组β-葡萄糖苷酶的生产，验证了pET系统在蓝藻中的功能活性，为利用光合生物反应器生产纤维素乙醇用酶提供了可行方案。结合第一代乙醇工业的CO2和酒糟副产物作为培养原料，该策略有望降低第二代乙醇生产成本并减轻环境负担。

创新点

首次在蓝藻中实现重组β-葡萄糖苷酶的生产；将pET表达系统成功应用于蓝藻；提出整合1G和2G乙醇生产流程的环保策略，利用CO2和酒糟作为培养原料。

研究对象（2）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Synechococcus elongatus PCC 7942 纤维素糖化（β-葡萄糖苷酶） AMBGL17 β-葡萄糖苷酶 AMBGL17 催化 来自亚马逊土壤宏基因组文库的GH3家族β-葡萄糖苷酶，受T7启动子控制，用于分解纤维二糖为葡萄糖。
Synechococcus elongatus PCC 7942 pET表达系统 T7RNAP T7 RNA聚合酶 调控 受镍诱导启动子PnrsB控制，特异性地转录T7启动子下游的AMBGL17基因，实现高水平的异源表达。

关键发现

  1. 成功构建双转基因蓝藻菌株S. elongatus P_{T7}AMBGL17
  2. 镍诱导后T7RNAP表达上升约5.5倍，AMBGL17基因表达上升22倍
  3. β-葡萄糖苷酶活性在6h时比野生型高1.7倍，18h时高7.4倍，24h时高3.5倍
  4. 添加5 μM NiSO4在延滞期对野生型和转基因菌株均有毒性，但在稳定期无毒性
  5. 外源基因整合不影响菌株生长
  6. AMBGL17具有优良的动力学参数（Vmax:16 mM/s，Km:0.30±0.017 mM，Kcat:38.57 s-1，Kcat/Km:128.56 s-1 mM-1）。

研究结论

pET系统在Synechococcus elongatus PCC 7942中功能活跃，能够高效表达异源β-葡萄糖苷酶，证明蓝藻可作为β-葡萄糖苷酶的生产平台。该策略有望通过利用CO2和酒糟降低生产成本，并减轻乙醇工业的环境影响。