Highly efficient biosynthesis of β-caryophyllene with a new sesquiterpene synthase from tobacco
- 作者
- Tao Cheng, Kai Zhang, Jing Guo, Qing Yang, Yiting Li, Mo Xian, Rubing Zhang
- 单位
- 中国科学院生物基材料重点实验室，青岛生物能源与过程研究所，中国科学院，青岛266101；中国农业科学院烟草研究所，青岛266101；中国科学院大学，北京100049
- 杂志
- Biotechnology for Biofuels（2022）
- DOI
- 10.1186/s13068-022-02136-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从烟草中发现新的β-石竹烯合酶，并通过代谢工程和发酵优化实现β-石竹烯的高效生物合成，解决产量低和产物胞内积累的问题。
研究策略
从烟草基因组中挖掘新倍半萜合酶基因tps7，在E. coli中异源表达并引入外源MVA途径；整合MVA下游基因到染色体以平衡代谢、减少副产物；利用原位萃取发酵缓解产物抑制，提高产量。
核心内容
本研究从烟草基因组中挖掘并鉴定了一个新的倍半萜合酶基因tps7，其编码的TPS7蛋白由556个氨基酸组成，具有β-石竹烯合酶活性。将该基因在大肠杆菌中异源表达，仅依赖内源MEP途径时摇瓶产量仅为0.81 mg/L；引入外源MVA途径后产量提升至18 mg/L，但伴随毒性副产物法尼基乙酸酯的积累并抑制菌体生长。为解决这一问题，研究者将MVA下游基因（MVK、PMK、MVD、IDI）整合至染色体，获得工程菌株CAR2，摇瓶产量提高6倍至100.3 mg/L，生物量提升1.5倍。补料分批发酵中CAR2产量达4319 mg/L；进一步采用正十二烷原位萃取发酵缓解产物抑制，摇瓶产量提高2.8倍，补料分批发酵产量进一步提升至5142 mg/L，葡萄糖转化率为4.4%。透射电镜观察显示产物主要以胞内液滴形式积累，发酵后期细胞形态异常甚至破裂。该研究通过新酶挖掘、代谢平衡优化和原位萃取发酵策略，实现了β-石竹烯微生物合成迄今报道的最高产量，展示了工业化应用潜力。
创新点
1. 发现并鉴定了烟草来源的高活性β-石竹烯合酶TPS7；2. 将MVA下游基因整合到染色体，显著提高产量并降低毒性副产物法尼基乙酸酯；3. 采用原位萃取发酵进一步提高β-石竹烯产量至5142 mg/L。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 外源MVA途径 | tps7 | TPS7 (β-caryophyllene synthase) | 催化 | 从烟草(Nicotiana tabacum L.)中发现的新倍半萜合酶，催化FPP生成β-石竹烯 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 外源MVA途径 | mvaE | MvaE (乙酰-CoA乙酰转移酶/HMG-CoA还原酶) | 催化 | 来自粪肠球菌，催化乙酰-CoA转化为甲羟戊酸的前两步反应 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 外源MVA途径 | mvaS | MvaS (HMG-CoA合酶) | 催化 | 来自粪肠球菌，催化HMG-CoA的合成 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 外源MVA途径 | MVK | MK (甲羟戊酸激酶) | 催化 | 来自酿酒酵母，催化甲羟戊酸磷酸化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 外源MVA途径 | PMK | PMK (磷酸甲羟戊酸激酶) | 催化 | 来自酿酒酵母，催化甲羟戊酸-5-磷酸进一步磷酸化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 外源MVA途径 | MVD | MVD (甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶) | 催化 | 来自酿酒酵母，催化甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成IPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 外源MVA途径 | IDI | IDI (IPP异构酶) | 催化 | 来自酿酒酵母，催化IPP与DMAPP的异构化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 外源MVA途径/倍半萜合成 | ispA | IspA (法尼基焦磷酸合酶/FPPS) | 催化 | 来自大肠杆菌，催化IPP和DMAPP生成FPP |
关键发现
- 从烟草中发现新β-石竹烯合酶TPS7（1671 bp，编码556氨基酸），在E. coli中表达后摇瓶产量0.81 mg/L（利用内源MEP途径）
- 引入外源MVA途径后，CAR1菌株摇瓶产量达到18 mg/L（15.4 mg/g DCW），但产生毒性副产物法尼基乙酸酯并抑制生长
- 将MVA下游基因（MVK、PMK、MVD、IDI）整合至染色体获得CAR2，摇瓶产量提高6倍至100.3 mg/L，生物量提高1.5倍，比产量68.5 mg/g DCW，生产速率4.3 mg/L/h
- 补料分批发酵中CAR2产量达到4319 mg/L（生产率67.5 mg/L/h，OD600=210）
- 使用正十二烷进行原位萃取，摇瓶产量提高2.8倍（253 mg/L vs 92 mg/L），补料分批发酵产量提高20%至5142 mg/L（生产率80.3 mg/L/h，OD600=140）
- 葡萄糖转化率为4.4%。产物主要胞内积累（摇瓶80%胞内），TEM显示24h后胞内出现液滴，36h后细胞形态异常甚至破裂。
研究结论
本研究从烟草中发现新β-石竹烯合酶TPS7，通过代谢工程和发酵优化构建了高效生产β-石竹烯的大肠杆菌菌株CAR2，最终通过原位萃取补料分批发酵获得5142 mg/L的产量，为目前微生物合成β-石竹烯的最高报道值，展示了工业化生产潜力。