Systematic optimization of gene expression of pentose phosphate pathway enhances ethanol production from a glucose/xylose mixed medium in a recombinant Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Yosuke Kobayashi, Takehiko Sahara, Satoru Ohgiya, Yoichi Kamagata, Kazuhiro E. Fujimori
- 单位
- Bioproduction Research Institute (BPRI), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japan; Bioproduction Research Institute (BPRI), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2-17-2-1 Tsukisamu-higashi, Toyohira, Sapporo, Hokkaido 062-8517, Japan
- 杂志
- AMB Express（2018）
- DOI
- 10.1186/s13568-018-0670-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在葡萄糖/木糖混合培养基中，系统优化戊糖磷酸途径（PPP）基因表达，以提升重组酿酒酵母在高温（36°C）下的木糖消耗速率和乙醇产量。
研究策略
以携带突变木糖异构酶（XI）基因的重组酿酒酵母 IR-2（SS82）为宿主，将来自酿酒酵母（ScTKL1）和耐热酵母马克思克鲁维酵母（KmTAL1、KmRKI1、KmRPE1）的 PPP 基因单独或组合整合至 GPD2 位点，在 85 g/L 葡萄糖 + 35 g/L 木糖的 YPDX 培养基、36°C 微氧条件下分批发酵，比较木糖消耗速率与乙醇产量，筛选最优基因组合，并与 XR-XDH 菌株及 PHO13 敲除效果进行比较。
核心内容
本研究以携带突变木糖异构酶（XI）基因的重组酿酒酵母 IR-2 为宿主，将来自酿酒酵母（ScTKL1）及耐热马克思克鲁维酵母（KmTAL1、KmRKI1、KmRPE1）的戊糖磷酸途径（PPP）基因单独或组合整合至 GPD2 位点，在 85 g/L 葡萄糖与 35 g/L 木糖混合培养基、36°C 微氧条件下系统评估其对木糖消耗和乙醇生产的影响。结果显示，单独过表达 ScTKL1 或 KmRKI1 即可使木糖消耗速率分别提高至对照的 1.66 倍和 1.42 倍；三基因组合 KmRKI1-KmTAL1-ScTKL1（YK246）效果最优，木糖消耗速率达 1.03 g/L/h，为对照 SS118 的 1.87 倍，乙醇产率达 0.45 g/g。与 XR-XDH 菌株相比，XI 菌株木糖醇产量低 2.8 倍、甘油低 1.5 倍，乙醇浓度更高（48.5 vs 45.1 g/L）。此外，PHO13 敲除在 XI 菌株中反而降低乙醇产率，不宜采用。该研究系统证明了优化 PPP 酶活性是增强重组菌木糖共发酵能力和纤维素乙醇生产的有效策略。
创新点
['系统评估了不同来源（酿酒酵母和马克思克鲁维酵母）PPP 基因在葡萄糖/木糖共发酵中的单独与组合效应，首次确定了 KmRKI1-KmTAL1-ScTKL1 三基因组合为最优', '发现单独过表达 ScTKL1 或 KmRKI1 即可显著提高木糖消耗速率（分别为对照的 1.66 倍和 1.42 倍）', '证实在 36°C 葡萄糖/木糖共发酵条件下，XI 菌株的乙醇产量高于 XR-XDH 菌株，且木糖醇和甘油副产物更少', '发现 PHO13 敲除在 XI 菌株中对木糖同化无改善作用，与 XR-XDH 菌株中的效果相反']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae IR-2 | 戊糖磷酸途径 | TKL1 | 转酮醇酶 | 催化 | 来自酿酒酵母（ScTKL1），单独过表达（YK185）使 24h 木糖消耗速率达 0.90 g/L/h（1.66 倍），乙醇产率 0.45 g/g |
| Saccharomyces cerevisiae IR-2 | 戊糖磷酸途径 | TAL1 | 转醛醇酶 | 催化 | 来自马克思克鲁维酵母（KmTAL1opt），与 ScTKL1 组合使用；另有 ScTAL1 用于全基因过表达对比 |
| Saccharomyces cerevisiae IR-2 | 戊糖磷酸途径 | RKI1 | 核糖-5-磷酸酮醇异构酶 | 催化 | 来自马克思克鲁维酵母（KmRKI1opt），单独过表达（YK183）使 24h 木糖消耗速率达 0.72 g/L/h（1.42 倍），乙醇产率 0.45 g/g |
| Saccharomyces cerevisiae IR-2 | 戊糖磷酸途径 | RPE1 | D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶 | 催化 | 来自马克思克鲁维酵母（KmRPE1opt），单独过表达无显著改善；另有 ScRPE1 |
| Saccharomyces cerevisiae IR-2 | 木糖代谢（XI 途径） | XI (LpXI T63I) | 木糖异构酶 | 催化 | 来自 Lachnoclostridium phytofermentans 的突变体，由 HSP12 启动子驱动，在 SS82 中表达，使木糖直接转化为木酮糖，避免木糖醇积累 |
| Saccharomyces cerevisiae IR-2 | 木糖代谢（木酮糖激酶） | XKS1 | 木酮糖激酶 | 催化 | 来自酿酒酵母 IR-2，与 XI 共表达以补偿木酮糖激酶活性 |
| Saccharomyces cerevisiae IR-2 | 木糖代谢（XR-XDH 途径） | XYL1/XYL2 | 木糖还原酶/木糖醇脱氢酶 | 催化 | 来自 Scheffersomyces stipitis，在对比菌株 YK001 及其衍生株中表达，用于与 XI 途径比较 |
| Saccharomyces cerevisiae IR-2 | 木糖代谢 | GRE3 | 醛酮还原酶（内源木糖还原酶） | 催化 | 在基础菌株 SS29 中被敲除（gre3Δ），以减少木糖醇生成 |
| Saccharomyces cerevisiae IR-2 | 戊糖磷酸途径/木糖代谢 | PHO13 | 推定碱性磷酸酶 | 调控 | 敲除在 XI 菌株中对木糖同化无改善，且在共发酵中降低乙醇产率（YK149: 0.33 g/g） |
| Saccharomyces cerevisiae IR-2 | 甘油代谢 | GPD2 | NAD 依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶 | 能量供给 | 敲除以减少甘油生成、改善乙醇产量，并作为 PPP 基因的染色体整合位点（gpd2Δ） |
关键发现
- 在 36°C、85 g/L 葡萄糖和 35 g/L 木糖的混合培养基中：对照菌株 SS82 的木糖消耗速率（24h）为
- 60 g/L/h，乙醇产量（72h）为
- 6 g/L，产率
- 41 g/g；单独过表达 ScTKL1（YK185）使木糖消耗速率提高至
- 90 g/L/h（1.66 倍），乙醇产率
- 45 g/g；单独过表达 KmRKI1（YK183）使木糖消耗速率达
- 72 g/L/h（1.42 倍），乙醇产率
- 45 g/g；三基因组合 KmRKI1-KmTAL1-ScTKL1（YK246）使木糖消耗速率达到最高
- 03 g/L/h，为对照 SS118（0.55 g/L/h）的
- 87 倍，乙醇产率
- 45 g/g。XI 菌株 SS82 的木糖醇产量比 XR-XDH 菌株 YK001 低
- 8 倍，甘油低
- 5 倍，乙醇浓度更高（48.5 vs
- 1 g/L）。PHO13 敲除在共发酵中降低乙醇产率（YK002:
- 28 g/g，YK149:
- 33 g/g），过表达全部 PPP 基因并敲除 PHO13 进一步降低（YK115:
- 13 g/g，YK150:
- 29 g/g）。
研究结论
通过系统优化 PPP 基因表达，确定了最优组合 KmRKI1-KmTAL1-ScTKL1，可使重组酿酒酵母在葡萄糖/木糖混合培养基中的木糖消耗速率提高 1.87 倍，乙醇产率达到 0.45 g/g，证明优化 PPP 活性是改善木糖代谢、提高纤维素乙醇生产的有效策略；同时指出 PHO13 敲除不应在 XI 菌株中采用。