高级醇 · 代谢工程文献库

← 返回列表

Efficient synthesis of limonene production in Yarrowia lipolytica by combinatorial engineering strategies

作者
Young-Kyoung Park, Lara Selles Vidal, David Bell, Jure Zabret, Mladen Soldat, Martin Kavšček, Rodrigo Ledesma-Amaro
单位
Department of Bioengineering and Centre for Synthetic Biology, Imperial College London, London SW72AZ, UK; INRAE, AgroParisTech, Micalis Institute, Université Paris-Saclay, 78350 Jouy-en-Josas, France; SynbiCITE Innovation and Knowledge Centre, Imperial College London, London SW7 2AZ, UK; Acies Bio d.o.o., 1000 Tehnološki Park 21 Ljubljana, Slovenia
杂志
Biotechnology for Biofuels（2024）
DOI
10.1186/s13068-024-02535-z
所属领域
代谢工程
关键词
BioproductionCompartmentalizationLimoneneMetabolic engineeringMonoterpenePeroxisomePrecision fermentationSynthetic biologyYarrowia lipolytica
阅读原文
查看 PDF 原文

解决的核心问题

解决解脂耶氏酵母中柠檬烯产量低的问题，通过组合工程策略提高D-和L-柠檬烯的合成效率，克服前体供应不足、与天然代谢途径竞争以及细胞毒性等挑战。

研究策略

采用组合工程策略：1）过表达MVA途径关键基因（tHMG、ERG20m、NDPS1）并构建ERG20m-LS融合蛋白以实现底物通道；2）多轮随机整合增加基因表达剂量；3）将柠檬烯合成酶及完整MVA途径靶向过氧化物酶体进行区室化，利用过氧化物酶体中的乙酰-CoA并减少竞争；4）优化发酵条件（碳源、初始OD、补料分批）。

研究路线图

100%
研究问题：解脂耶氏酵母柠檬烯产量低，前体供应不足、代谢竞争与细胞毒性等挑战
策略：组合工程改造MVA途径基因表达（tHMG、ERG20m、NDPS1）、融合蛋白构建与过氧化物酶体区室化
关键改造①：ERG20m-LS融合蛋白底物通道，减少中间产物损失
关键改造②：完整MVA途径与柠檬烯合酶共靶向过氧化物酶体（PTS1/PTS2）
关键改造③：多轮随机整合提高基因表达剂量，优化发酵（碳源、OD、补料分批）
结果：D-柠檬烯最高产69.3 mg/L（1.81 mg/g DCW），过氧化物酶体靶向较对照提高102~159倍
结论：过氧化物酶体区室化利于单萜合成，为其他单萜微生物生产提供新途径
Text is not SVG - cannot display

下载 .drawio 源文件

核心内容

该研究在解脂耶氏酵母中通过组合工程策略实现柠檬烯的高效合成。作者过表达MVA途径关键基因并构建ERG20m与柠檬烯合酶的融合蛋白以增强底物通道，使D-柠檬烯产量较单独表达提高14.8倍。随后通过多轮随机整合增加基因剂量，使L-和D-柠檬烯在摇瓶中分别达到29.4 mg/L和24.8 mg/L。进一步将完整MVA途径及柠檬烯合酶靶向过氧化物酶体，利用其中的乙酰-CoA并减少与天然代谢的竞争，使D-柠檬烯产量提升至47.8 mg/L，较对照提高102.6倍。结合碳源优化与补料分批发酵，最终产量达69.3 mg/L（1.81 mg/gDCW）。该工作证明过氧化物酶体区室化是单萜微生物合成的有效策略，为其他单萜类产品的高效生产提供了可行思路。

创新点

['构建ERG20m与柠檬烯合酶的融合蛋白，增强GPP向柠檬烯的转化并减少中间产物损失', '首次将完整MVA途径与柠檬烯合酶共同靶向过氧化物酶体，显著提高D-柠檬烯产量', '通过多轮整合和补料分批发酵，实现柠檬烯在解脂耶氏酵母中的高效合成']

研究对象（11）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Yarrowia lipolytica MVA途径 tHMG 截短的HMG-CoA还原酶 催化 过表达提高MVA途径通量，为柠檬烯合成提供前体；可在细胞质或过氧化物酶体表达
Yarrowia lipolytica 柠檬烯合成 D-LS D-柠檬烯合酶（来自Citrus limon） 催化 催化GPP/NPP生成D-柠檬烯；可定位于过氧化物酶体（PTS1/PTS2）
Yarrowia lipolytica 柠檬烯合成 L-LS L-柠檬烯合酶（来自Mentha spicata） 催化 催化GPP生成L-柠檬烯
Yarrowia lipolytica 萜烯前体合成 ERG20（ERG20m） 香叶基二磷酸合酶（突变体） 催化 突变体增强GPP供给；与LS融合表达以提高底物通道效率
Yarrowia lipolytica 正交NPP途径 NDPS1 橙花基二磷酸合酶（来自Solanum lycopersicum） 催化 催化IPP/DMAPP生成NPP，作为替代前体
Yarrowia lipolytica MVA途径 ERG10 乙酰-CoA乙酰转移酶 催化 参与MVA途径上游反应；在过氧化物酶体定位时用于构建完整途径
Yarrowia lipolytica MVA途径 ERG13 HMG-CoA合酶 催化 参与MVA途径；在过氧化物酶体定位时用于构建完整途径
Yarrowia lipolytica MVA途径 ERG12 甲羟戊酸激酶 催化 参与MVA途径；细胞质或过氧化物酶体表达均能增加前体供给
Yarrowia lipolytica MVA途径 ERG8 磷酸甲羟戊酸激酶 催化 参与MVA途径；细胞质或过氧化物酶体表达均能增加前体供给
Yarrowia lipolytica MVA途径 ERG19 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 催化 参与MVA途径；在过氧化物酶体定位时用于构建完整途径
Yarrowia lipolytica MVA途径 IDI 异戊烯基二磷酸δ-异构酶 催化 催化IPP与DMAPP互变；在过氧化物酶体定位时用于构建完整途径

关键发现

  1. 融合表达ERG20m/(D)-LS使D-柠檬烯产量较单独表达提高14.8倍
  2. 多轮整合后L-柠檬烯和D-柠檬烯产量分别达到29.4 mg/L和24.8 mg/L（摇瓶条件）
  3. 将D-LS和ERG20m靶向过氧化物酶体后产量达3.4 mg/L，较单独表达D-LS提高14.9倍
  4. 整个MVA途径靶向过氧化物酶体使D-柠檬烯产量达到47.8 mg/L，较对照提高102.6倍（PTS1）和159.3倍（PTS2）
  5. 补料分批发酵最高产量达69.3 mg/L，对应1.81 mg/gDCW。

研究结论

通过组合工程策略成功在解脂耶氏酵母中实现柠檬烯的高效合成，证明过氧化物酶体区室化有利于单萜生物合成，为其他单萜的微生物生产提供了新途径。