高级醇 · 代谢工程文献库

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Expression and Characterization of a Class III Alcohol Dehydrogenase Gene from Gluconobacter frateurii in the Presence of Methanol during Glyceric Acid Production from Glycerol

作者
Shun Sato, Naoki Morita, Dai Kitamoto, Hiroshi Habe
单位
国立先进工业科学与技术研究所（AIST）可持续化学创新研究所；国立先进工业科学与技术研究所（AIST）生物生产研究所
杂志
Journal of Oleo Science（2013）
DOI
10.5650/jos.62.835
所属领域
代谢工程
关键词
adhC弗拉特氏葡萄糖杆菌甘油酸甲醇甲醛脱氢酶醋酸菌
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解决的核心问题

解析甲醇存在导致甘油酸（GA）产量下降的分子机制，并鉴定参与甲醇代谢的关键酶

研究策略

对Gluconobacter frateurii NBRC103465在甲醇存在下的甘油发酵进行比较转录组分析，将上调的adhC同源基因克隆并在大肠杆菌中异源表达，通过SDS-PAGE和酶活测定表征其功能，并测定G. frateurii细胞在甲醇培养下的GD-FALDH活性

研究路线图

100%
研究问题：甲醇存在导致甘油酸产量下降的分子机制
策略：比较转录组分析+异源表达+酶活表征
关键改造：克隆adhC基因并在E. coli中异源表达
关键改造：SDS-PAGE验证39 kDa重组蛋白
结果1：adhC转录上调1.99倍（12h）
结果2：GD-FALDH活性提高10倍（异源）
结果3：甲醇培养GD-FALDH活性高5倍
结果4：GA产量下降至4.5 g/L，DHA升至27.9 g/L
结论：adhC编码GD-FALDH，参与甲醛分解代谢，增强其功能有望利用粗甘油生产
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核心内容

该研究以氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter frateurii NBRC103465为对象，探究甲醇存在导致甘油酸产量下降的分子机制。通过比较转录组分析，发现甲醇培养12小时后adhC基因表达上调1.99倍。将该基因克隆并在大肠杆菌中异源表达，获得约39 kDa的蛋白，其可溶组分的甲醛脱氢酶（GD-FALDH）活性较对照提高10倍，证实其编码NAD和谷胱甘肽依赖的III类醇脱氢酶。在含1%甲醇的甘油培养基中培养24小时后，菌株GD-FALDH活性较无甲醇培养提高5倍，且甘油酸产量从18.5 g/L降至4.5 g/L，而二羟基丙酮产量增至27.9 g/L。研究表明adhC参与甲醇来源甲醛的分解代谢，使碳流偏向副产物生成从而降低甘油酸产量，提示增强adhC功能可能有助于该菌利用含甲醇粗甘油生产甘油酸等化学品。

创新点

首次从醋酸菌中克隆并功能鉴定III类醇脱氢酶基因adhC，证明其编码NAD和谷胱甘肽依赖的甲醛脱氢酶（GD-FALDH），并提出甲醇在G. frateurii中的分解代谢途径

研究对象（8）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Gluconobacter frateurii NBRC103465 甲醇/甲醛分解代谢 adhC ADHC_Gf (III类醇脱氢酶) 催化 编码NAD和谷胱甘肽依赖的甲醛脱氢酶，甲醇存在时转录上调1.99倍
Escherichia coli DH5α 异源表达 adhC ADHC_Gf 催化 重组表达产生39 kDa蛋白，GD-FALDH活性比对照高10倍
Gluconobacter frateurii NBRC103465 乙二醛/氨基酸代谢 gloA 推定乙二醛酶 催化 甲醇存在下上调2.65/2.26/1.87倍
Gluconobacter frateurii NBRC103465 甲硫氨酸合成 metE 5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-同型半胱氨酸S-甲基转移酶 催化 甲醇存在下上调2.39倍
Gluconobacter frateurii NBRC103465 铁转运 cirA 外膜受体蛋白（铁转运） 转运 甲醇存在下上调1.99倍
Gluconobacter frateurii NBRC103465 铁/维他命B12转运 fepC ABC型钴胺素/Fe3+-铁载体转运系统ATP酶组分 转运 甲醇存在下上调1.62倍
Gluconobacter frateurii NBRC103465 钴胺素生物合成 cobN 钴胺素生物合成蛋白CobN和Mg-螯合酶 催化 甲醇存在下上调1.54倍
Gluconobacter frateurii NBRC103465 氨基酸代谢 lysA 鸟氨酸脱羧酶 催化 甲醇存在下上调1.66倍

关键发现

  1. 甲醇存在下培养12 h，adhC基因表达上调1.99倍
  2. 重组E. coli中表达出约39 kDa蛋白（预测分子量39.1 kDa）
  3. 异源表达后细胞可溶组分的GD-FALDH活性比对照高10倍
  4. G. frateurii在含1%甲醇的甘油中培养24 h后，GD-FALDH活性比无甲醇培养高5倍
  5. 甲醇存在时24 h GA产量仅为4.5 g/L（无甲醇为18.5 g/L），DHA产量增至27.9 g/L（无甲醇为18.5 g/L）；甲醇在培养12 h和24 h的残留浓度分别为2.9和12.4 g/L

研究结论

adhC编码GD-FALDH，参与甲醇来源甲醛的分解代谢，导致碳流向DHA等副产物偏移并降低GA产量；增强adhC功能可能使G. frateurii有效利用含甲醇粗甘油生产甘油酸等化学品