Molecular Cloning, Functional Expression and Characterization of d -Limonene Synthase from Schizonepeta tenuifolia
- 作者
- Takuro MARUYAMA, Michihiro ITO, Fumiyuki KIUCHI, Gisho HONDA
- 单位
- Department of Pharmacognosy, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyoto University
- 杂志
- Biological and Pharmaceutical Bulletin（2001）
- DOI
- 10.1248/bpb.24.373
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
d-柠檬烯合酶基因尚未克隆，柠檬烯生物合成中立体化学调控的分子机制不明
研究策略
采用反向遗传学方法，基于植物萜烯合酶保守序列设计简并引物，通过PCR、3'/5' RACE从裂叶荆芥中克隆d-柠檬烯合酶(dLMS)全长cDNA；利用无细胞转录/翻译系统表达重组蛋白，通过GC-MS和手性柱分析酶促产物；比较dLMS与已知l-柠檬烯合酶的氨基酸序列，推测立体化学调控关键残基。
核心内容
该研究采用反向遗传学策略，基于植物萜烯合酶保守序列设计简并引物，通过PCR及3'/5' RACE技术从裂叶荆芥中克隆了d-柠檬烯合酶（dLMS）全长cDNA，并利用无细胞转录/翻译系统表达重组蛋白，经GC-MS和手性柱分析酶促产物。dLMS cDNA全长2108 bp，开放阅读框1860 bp，编码620个氨基酸，推测含N端质体转运肽及DDxxD motif。重组蛋白表观分子量约62 kDa。体外酶活实验表明，dLMS催化香叶基焦磷酸生成以d-柠檬烯为主产物的单萜，经手性分析确证产物立体构型为d型。序列比较显示，dLMS与薄荷、留兰香、紫苏等植物的l-柠檬烯合酶氨基酸一致性为61.3%至68.5%，但活性位点中F227、F392、Y596等芳香/酸性残基及T194/P414等存在差异。该工作首次克隆了植物d-柠檬烯合酶基因，揭示柠檬烯立体化学选择可能由活性位点少量关键残基决定，为萜烯合酶立体调控机制研究提供基础。
创新点
首次从植物中克隆获得d-柠檬烯合酶基因；通过序列比较提出柠檬烯立体化学调控可能依赖于关键氨基酸残基的微小突变，并识别了若干潜在的调控位点。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 无细胞转录/翻译系统(TNT T7 Quick Coupled Transcription/Translation System) | 单萜生物合成途径(GPP→柠檬烯) | dLMS | d-柠檬烯合酶 | 催化 | 催化GPP环化生成d-柠檬烯；重组蛋白用于体外酶活检测 |
关键发现
- dLMS cDNA全长2108 bp，含1860 bp开放阅读框，编码620个氨基酸
- 推测蛋白含N端质体转运肽(1-72 aa)及DDxxD motif(xx=IY)
- 重组蛋白表观分子量约62 kDa(理论计算64 kDa)
- 体外酶活实验表明dLMS催化GPP生成柠檬烯(主产物)及少量未知环状单萜副产物(分子量136)
- 手性GC-MS确认产物为d-柠檬烯
- dLMS与Mentha longifolia、M. spicata、Perilla frutescens、P. citriodora的l-柠檬烯合酶氨基酸序列一致性分别为68.5%、67.7%、61.4%、61.3%
- 与l-柠檬烯合酶相比，dLMS在F227、F392、Y596、E438、E501等芳香/酸性残基及T194/P414等残基存在差异。
研究结论
克隆并鉴定了裂叶荆芥d-柠檬烯合酶基因(dLMS)，其编码的酶特异性产生d-柠檬烯；dLMS与l-柠檬烯合酶在结构上高度相似，柠檬烯立体化学的选择可能由活性位点中少数氨基酸残基的微小突变决定，为解析萜烯合酶立体化学调控机制奠定了基础。