Malolactic Fermentation by Engineered Saccharomyces cerevisiae as Compared with Engineered Schizosaccharomyces pombe
- 作者
- VIRGINIE ANSANAY, SYLVIE DEQUIN, CAROLE CAMARASA, VALERIE SCHAEFFER, JEAN-PIERRE GRIVET, BRUNO BLONDIN, JEAN-MICHEL SALMON, PIERRE BARRE
- 单位
- IPV-Laboratoire de Microbiologie et Technologie des Fermentation, INRA-ENSAM 2 Place Viala F-34060, Montpellier cedex 01, France; Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS, 1A Av. de la Recherche Scientifique, F-45071 Orléans Cedex 02, France
- 杂志
- Yeast（1996）
- DOI
- 10.1002/(SICI)1097-0061(19960315)12:3<215::AID-YEA903>3.0.CO;2-M
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在葡萄酒酿造中，苹果酸乳酸发酵（MLF）通常由乳酸菌进行，但乳酸菌在酒中生长不良常导致MLF延迟或失败。本研究旨在通过将乳酸乳球菌的苹果酸乳酸酶基因（mleS）异源表达于酿酒酵母和粟酒裂殖酵母中，实现由单一酵母同时完成酒精发酵和苹果酸乳酸发酵，并评估两种重组酵母降解L-苹果酸的能力及其限速因素。
研究策略
将乳酸乳球菌的mleS基因分别克隆到酿酒酵母表达载体pM1（ADH1启动子，多拷贝）和粟酒裂殖酵母表达载体pARTM4（粟酒裂殖酵母ADH1启动子）中，构建重组菌株。通过发酵实验监测L-苹果酸降解和L-乳酸生成，利用¹³C葡萄糖和¹⁴C标记L-苹果酸的同位素示踪（NMR和放射性计数）追踪L-乳酸的来源，比较两种重组酵母的MLF完成程度。
研究路线图
创新点
['在酿酒酵母中高效表达乳酸乳球菌的苹果酸乳酸酶，其比活力是乳酸乳球菌的3倍', '利用¹³C和¹⁴C双同位素示踪定量证明重组酿酒酵母产生的L-乳酸75%来自内源L-苹果酸，25%来自外源L-苹果酸', '证明重组酿酒酵母中所有被降解的外源L-苹果酸均经苹果酸乳酸酶转化为L-乳酸，表明该酶与内源苹果酸代谢途径竞争时具有绝对优势', '在粟酒裂殖酵母中实现完全的苹果酸乳酸发酵，并揭示酿酒酵母完成MLF的限速步骤是L-苹果酸的跨膜转运']
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae V5 (MATA ura3)，源自香槟酒酵母 | 苹果酸代谢/糖酵解 | mleS（源自Lactococcus lactis） | 苹果酸乳酸酶（MLE） | 催化 | 通过多拷贝质粒pM1表达，表达受ADH1启动子和终止子调控；MLE催化L-苹果酸转化为L-乳酸和CO₂，比活力18 μmol/min/mg蛋白 |
| Schizosaccharomyces pombe leu1-32 h+ | 苹果酸代谢 | mleS（源自Lactococcus lactis） | 苹果酸乳酸酶（MLE） | 催化 | 通过质粒pARTM4表达，受粟酒裂殖酵母ADH1启动子调控；表达水平与酿酒酵母重组菌相当，实现完全苹果酸乳酸发酵，70–80%外源L-苹果酸转化为L-乳酸 |
关键发现
- ['酿酒酵母V5/pM1菌株的苹果酸乳酸酶比活力为18 μmol L-乳酸/min/mg蛋白，是乳酸乳球菌IL1441（6 μmol/min/mg）的3倍', '在200 g/L葡萄糖、pH 3.5、含3 g/L外源L-苹果酸的模拟葡萄酒条件下，酿酒酵母V5/pM1产生约3 g/L L-乳酸
- 无外源L-苹果酸时L-乳酸产量降低20%（约2.4 g/L）
- 对照菌株V5/pVT100-U不产生L-乳酸', '酿酒酵母（对照和重组菌）仅降解少量外源L-苹果酸（0.4–0.5 g/L），重组菌的降解量比对照增加约25%', '¹³C葡萄糖示踪表明重组酿酒酵母产生的L-乳酸大部分来自葡萄糖，¹⁴C标记实验证实最终L-乳酸中75%来自内源L-苹果酸，25%来自外源L-苹果酸
- 外源L-苹果酸消耗4.5 mM，产生4.4 mM标记L-乳酸，转化率近100%', '粟酒裂殖酵母pARTM4菌株在含3 g/L L-苹果酸时产生高达1.6 g/L L-乳酸，且L-苹果酸被完全消耗
- 无L-苹果酸时仅产痕量L-乳酸
- 70–80%的外源L-苹果酸被转化为L-乳酸', '重组酿酒酵母和粟酒裂殖酵母的生长动力学、最终生物量和发酵200 g/L葡萄糖的能力均未受MLE表达影响']
研究结论
乳酸乳球菌的苹果酸乳酸酶在酿酒酵母和粟酒裂殖酵母中均能高水平表达且功能正常。在酿酒酵母中，MLE与内源苹果酸代谢途径竞争时占据绝对优势，所有被降解的外源L-苹果酸均转化为L-乳酸，但酿酒酵母仅能降解少量外源L-苹果酸，主要限速步骤是L-苹果酸的跨膜转运（仅靠简单扩散）。相比之下，粟酒裂殖酵母具有高效的苹果酸转运系统，表达MLE后能实现完全的苹果酸乳酸发酵，将大部分L-苹果酸转化为L-乳酸和CO₂。重组菌株的生理特性未受明显影响，粟酒裂殖酵母工程菌有望用于葡萄酒酿造中的苹果酸降解，或采用固定化细胞反应器实现温和降酸。