During the Initiation of Fermentation Overexpression of Hexokinase PII in Yeast Transiently Causes a Similar Deregulation of Glycolysis as Deletion of Tps1
- 作者
- JOSÉ ROBERTO ERNANDES, CATHERINE DE MEIRSMAN, FILIP ROLLAND, JORIS WINDERICKX, JOHANNES DE WINDE, ROGELIO LOPES BRANDÃO, JOHAN M. THEVELEIN
- 单位
- Laboratorium voor Moleculaire Cellbiologie, Katholieke Universiteit Leuven; Department of Biochemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University; Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Microrganismos, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto
- 杂志
- Yeast（1998）
- DOI
- 10.1002/(SICI)1097-0061(199802)14:3<255::AID-YEA228>3.0.CO;2-N
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究酵母中Tps1依赖性控制对糖酵解中葡萄糖流入的限制机制，以及过量表达己糖激酶PII是否会模拟tps1缺失造成的代谢失调。
研究策略
构建多拷贝质粒和PGK强启动子驱动的HXK2过量表达菌株，通过比较野生型、tps1Δ和过量表达菌株在葡萄糖添加后的糖酵解中间产物、ATP、无机磷、胞内自由葡萄糖水平及乙醇产生等，评估己糖激酶过量表达的影响。
研究路线图
创新点
1. 发现己糖激酶PII过量表达（最高约50倍）不会引起生长缺陷，但会在发酵启动时短暂模拟tps1缺失的代谢失调；2. 建立基于L-葡萄糖的胞内自由葡萄糖测定方法；3. 揭示发酵启动阶段己糖激酶是糖酵解前段的重要限速步骤。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | HXK2 | Hexokinase PII | 催化 | 过量表达约20倍（YEp-HXK2）和50倍（YEp-PGK/HXK2），被Tps1依赖性控制抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae | 海藻糖合成/糖酵解调控 | TPS1 | Trehalose-6-phosphate synthase | 调控 | 缺失导致己糖激酶活性失控、糖磷酸过度积累和ATP耗竭 |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | HXK1 | Hexokinase PI | 催化 | 在三重激酶缺失突变体hxk1Δ hxk2Δ glk1Δ中用于测定胞内自由葡萄糖 |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解 | GLK1 | Glucokinase | 催化 | 同上 |
关键发现
- 与野生型相比，含YEp-HXK2的菌株己糖激酶活性（以葡萄糖为底物）由201 mU/mg升至4250 mU/mg（约20倍），含YEp-PGK/HXK2的菌株升至13230 mU/mg（约50倍）
- 过量表达菌株在葡萄糖添加后葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸和果糖-1,6-二磷酸水平升高，ATP和Pi水平相应下降，代谢模式短暂介于野生型和tps1Δ之间
- 100 mM葡萄糖时，过量表达菌株的ATP初始下降类似tps1Δ，但随后恢复
- 胞内自由葡萄糖水平：野生型为0.5-2 mM，hxk1Δ hxk2Δ glk1Δ为约10 mM，tps1Δ为2-3 mM，过量表达菌株不降低
- 过量表达未显著提高乙醇产量和葡萄糖消耗速率，仅在低葡萄糖浓度下略有增加。
研究结论
过量表达己糖激酶PII不会导致与tps1缺失相同的生长缺陷，但会在发酵启动时短暂模拟其代谢失调；Tps1依赖性控制系统能够快速适应高达50倍的己糖激酶过量，维持正常生长；己糖激酶在发酵启动阶段对糖酵解前段具有显著控制作用。