Reduced Pyruvate Decarboxylase and Increased Glycerol-3-phosphate Dehydrogenase [NAD+] Levels Enhance Glycerol Production in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Elke Nevoigt, Ulf Stahl
- 单位
- Institut für Biotechnologie, Fachgebiet Mikrobiologie und Genetik, Technische Universität Berlin, Gustav-Meyer-Allee 25, D-13355 Berlin, Germany
- 杂志
- Yeast（1996）
- DOI
- 10.1002/(SICI)1097-0061(199610)12:13<1331::AID-YEA28>3.0.CO;2-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究影响酿酒酵母甘油产量的因素，特别是降低丙酮酸脱羧酶(PDC)活性和增加NAD依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)活性对甘油生产的影响。
研究策略
通过删除PDC2基因降低PDC活性，通过多拷贝质粒YEpKmR GPD1过表达GPD1基因增加GPD活性，并组合两种修饰，在限氧条件下进行批次发酵，分析发酵产物、酶活、碳/氧化还原平衡和葡萄糖代谢通量。
研究路线图
创新点
首次证明单独过表达GPD1足以大幅增加甘油产量，并明确GPD是甘油形成的限速步骤；通过组合pdc突变和GPD1过表达实现甘油产量8.1倍提升。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甘油合成 | GPD1 | NAD依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 过表达使GPD活性提高约20倍（1.23 U/mg vs 0.06 U/mg） |
| Saccharomyces cerevisiae | 丙酮酸代谢/乙醇发酵 | PDC2 | PDC2调控蛋白 | 调控 | 基因缺失导致PDC活性降至野生型的19%（0.25 U/mg vs 1.29 U/mg） |
| Saccharomyces cerevisiae | 丙酮酸代谢 | PDC1 | 丙酮酸脱羧酶 | 催化 | 受PDC2调控，在pdc2突变体中表达下降 |
关键发现
- pdc突变体（19%残存PDC活性）甘油产量为野生型的4.7倍（6.8 mmol/L升至31.7 mmol/L）；GPD1过表达（20倍GPD活性）为6.5倍（44.1 mmol/L）；组合菌株为8.1倍（54.9 mmol/L）。特定甘油形成速率：pdc突变体为野生型2倍（1.5 vs
- 8 mmol/h per g dry weight），GPD1过表达在野生型背景提高6-7倍（5.1 mmol/h per g dry weight），在pdc突变体背景为2.5 mmol/h per g dry weight。GPD比活从0.06 U/mg增至1.23 U/mg；PDC活性为0.25 U/mg vs
- 29 U/mg。乙醇产量分别降至111.3、122.0和93.0 mmol/L（野生型为171.1 mmol/L）。
研究结论
降低PDC活性或增加GPD活性均能显著提高甘油产量，两者组合效果更佳，甘油产量可达野生型的8.1倍；GPD是甘油合成的限速酶，增加GPD活性是促进甘油过量生产的关键。