Alcohol Oxidase Hybrid Oligomers Formed In Vivo and In Vitro
- 作者
- TOMOYUKI NAKAGAWA, HIROYUKI MUKAIYAMA, HIROYA YURIMOTO, YASUYOSHI SAKAI, NOBUO KATO
- 单位
- Division of Applied Life Sciences, Graduate School of Agriculture, Kyoto University, Kitashirakawa-Oiwake, Sakyo-ku, Kyoto 606-8502, Japan
- 杂志
- Yeast（1999）
- DOI
- 10.1002/(SICI)1097-0061(19990915)15:12<1223::AID-YEA450>3.0.CO;2-X
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明Pichia methanolica中九种醇氧化酶（AOD）同工酶条带的分子基础，验证其是否源于两个基因产物的杂合八聚体，并揭示两个AOD基因的调控特征。
研究策略
克隆P. methanolica中两个AOD编码基因MOD1和MOD2，在Candida boidinii的AOD1缺失菌株中分别或共表达；结合体外解离/重装配实验和酶谱分析，证明杂合八聚体的形成；并通过不同甲醇浓度下的酶谱变化，分析基因表达调控。
研究路线图
创新点
首次证实九条AOD条带由两个基因产物形成七个杂合八聚体和两个同源八聚体，而非翻译后修饰；发现MOD1和MOD2受甲醇浓度差异调控，赋予细胞对甲醇亲和力的灵活调节。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia methanolica | 甲醇代谢 | MOD1 | Mod1p | 催化 | 编码醇氧化酶亚基，低甲醇浓度下优先表达，同源八聚体MOD-A对甲醇Km值为0.56 mM |
| Pichia methanolica | 甲醇代谢 | MOD2 | Mod2p | 催化 | 编码醇氧化酶亚基，高甲醇浓度下诱导表达，同源八聚体MOD-B对甲醇Km值为5.6 mM |
| Candida boidinii | 甲醇代谢 | AOD1 | Aod1p | 催化 | 宿主自身醇氧化酶基因，被敲除用于构建异源表达菌株aod1Δ |
| Candida boidinii | 甲醇代谢 | MOD1, MOD2 | Mod1p, Mod2p | 催化 | 异源共表达于aod1Δ菌株（pMOD12转化体），形成与P. methanolica相同的九条AOD杂合条带 |
关键发现
- P. methanolica甲醇生长细胞中检测到九条AOD活性条带
- MOD1和MOD2编码蛋白的氨基酸相似性为85%
- MOD-A（Mod1p同源八聚体）对甲醇的Km值为0.56 mM，MOD-B（Mod2p同源八聚体）为5.6 mM
- 在C. boidinii aod1Δ菌株中表达MOD1或MOD2使菌株能缓慢生长于甲醇，AOD酶活分别为0.12和0.11 U/mg蛋白，而表达C. boidinii自身AOD1的菌株为0.92 U/mg蛋白
- 共表达MOD1和MOD2在体内产生九条条带，体外混合不同比例的Mod1p和Mod2p亚基也产生九条条带
- 随着培养基中甲醇浓度增加，Mod2p/Mod1p比例升高。
研究结论
P. methanolica中九种AOD同工酶形式是由Mod1p和Mod2p组成的两个同源八聚体和七个杂合八聚体。MOD1在低甲醇浓度（甚至无甲醇时）表达，MOD2则需要较高甲醇浓度诱导，两者协调表达使细胞能够适应甲醇浓度的动态变化。