A Strong Carbon Source Effect Is Mediated by pUC Plasmid Sequences in a Series of Classical Yeast Vectors Designed for Promoter Characterization
- 作者
- K. Pauwels, A. Abadjieva, P. Hilven, M. Crabeel
- 单位
- Department of Microbiology, Vrije Universiteit Brussels and Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie, clo Research Institute, COOVI, 1 E. Gryson av., B-1070 Brussels, Belgium
- 杂志
- Yeast（1999）
- DOI
- 10.1002/(SICI)1097-0061(19990915)15:12<1269::AID-YEA453>3.0.CO;2-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
使用YIp356/YEp356R系列经典酵母载体进行启动子表征时，ARG2启动子表现出强烈的碳源调控，需确定该调控是否真实以及其分子机制。
研究策略
构建不同长度的ARG2和ARG11启动子-lacZ融合报告质粒，通过插入额外DNA片段、使用snf1和ssn6突变体，以及PCR扩增pUC载体片段进行定位，分析β-半乳糖苷酶活性变化。
研究路线图
创新点
首次揭示pUC18载体序列中位于636-879位点的顺式元件可人为地介导碳源依赖的转录激活，并警示经典酵母载体中此假象对启动子研究的影响。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae MG471 | 精氨酸生物合成 | ARG2 | Arg2p | 催化 | 启动子区域（-270至+15或-1233至+15）融合lacZ，研究碳源调控 |
| Saccharomyces cerevisiae MG471 | 精氨酸生物合成 | ARG3 | Arg3p | 催化 | ORF作为插入DNA构建pKAT22对照质粒，验证质粒序列效应 |
| Saccharomyces cerevisiae MG471 | 精氨酸生物合成/线粒体转运 | ARG11 | Arg11p | 转运 | 线粒体鸟氨酸载体；不同长度5'上游区域（-203、-360、-682）融合lacZ |
| Saccharomyces cerevisiae MG471 | 报告基因 | lacZ | β-半乳糖苷酶 | 催化 | 用于定量启动子活性的报告基因 |
| Saccharomyces cerevisiae MG471 | 碳源代谢调控/SNF1信号通路 | SNF1 | Snf1p | 调控 | snf1缺失突变体PI3，其去抑制效应消失 |
| Saccharomyces cerevisiae MCY1974 | 碳源代谢调控 | SSN6 | Ssn6p | 调控 | ssn6-Δ9突变体中未观察到去抑制，但菌株非等基因 |
关键发现
- 在非葡萄糖碳源上，ARG2启动子驱动的lacZ表达比葡萄糖培养高5-10倍（半乳糖）至40倍（乙醇）
- 从高糖(3%)转到低糖(0.05%)后4小时表达增加30倍
- pKAT3（2μ载体）基础活性比整合型高18倍，乙醇下增强40倍
- pKAT13在乙醇下增加近20倍
- 插入任意DNA于ARG2启动子上游可消除去抑制效应
- ARG11启动子近端203 bp片段在低糖下去抑制，360 bp片段则无此效应
- 鉴定出pUC18片段255 bp（对应位置636-879）足够介导该调控，且原方向恢复效应完全（pAA23），反向部分恢复（pAA23-w）。
研究结论
YEp/YIp 353-368系列载体中pUC质粒序列介导人为的碳源调控，该调控依赖Snf1p和可能Ssn6p，并非真正的ARG2或ARG11启动子调控。使用这些经典载体研究碳源响应启动子时必须警惕此假象，该序列也可被利用于人工增强非葡萄糖条件下的基因表达。