Fermentation of Starch By Klebsiella oxytoca P2, Containing Plasmids with α-Amylase and Pullulanase Genes
- 作者
- Vera Lúcia dos Santos, Elza Fernandes Araújo, Everaldo Gonçalves de Barros, Walter Vieira Guimarães
- 单位
- Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Viçosa; Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（1999）
- DOI
- 10.1002/(SICI)1097-0290(19991220)65:6<673::AID-BIT8>3.0.CO;2-J
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
降低淀粉发酵产乙醇中商业酶成本，实现淀粉直接发酵产乙醇。评估携带嗜热α-淀粉酶和支链淀粉酶基因的质粒对Klebsiella oxytoca P2酒精发酵的影响。
研究策略
将Bacillus stearothermophilus的α-淀粉酶基因和Thermoanaerobium brockii的支链淀粉酶基因克隆到质粒pC46中，转入产乙醇的Klebsiella oxytoca P2菌株。进行一步发酵（直接发酵淀粉）和两步发酵（先将淀粉在60°C预水解24h再发酵），并检测乙醇产量、酶活性和副产物。
研究路线图
创新点
利用嗜热淀粉酶基因的质粒使菌株具备直接发酵淀粉的能力；两步发酵策略（预水解）显著缩短发酵时间并将乙醇理论产率提高到约90%；发现淀粉浓度对α-淀粉酶和支链淀粉酶活性的不同影响。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Klebsiella oxytoca P2 | 乙醇发酵 | pdc | 丙酮酸脱羧酶 | 催化 | 来自Zymomonas mobilis，染色体整合 |
| Klebsiella oxytoca P2 | 乙醇发酵 | adhB | 乙醇脱氢酶II | 催化 | 来自Zymomonas mobilis，染色体整合 |
| Klebsiella oxytoca P2 | 淀粉水解 | α-淀粉酶基因 | α-淀粉酶 | 催化 | 来自Bacillus stearothermophilus，位于质粒pC46上 |
| Klebsiella oxytoca P2 | 淀粉脱支 | 支链淀粉酶基因 | 支链淀粉酶 | 催化 | 来自Thermoanaerobium brockii，位于质粒pC46上 |
关键发现
- K. oxytoca P2(pC46)发酵5%麦芽糖时最大乙醇产量为19 g/L（72h），产率为0.34 g乙醇/g麦芽糖；发酵1%、2%、4%淀粉时最大乙醇产率为0.38、0.40、0.36 g/g淀粉，分别为理论产率的68%、71%、64%。
- 两步发酵（60°C预水解24h）后，1%、2%、4%淀粉的理论产率分别达到96.0%、89.2%、89.0%，最大乙醇产量时间从36-48h缩短至24h；体积产率分别为0.28、0.53、1.27 g/L/h。
- pC46质粒使原始K. oxytoca P2乙醇产量降低25-33%。
- 随淀粉浓度增加，胞内α-淀粉酶活性降低（从86.67降至56.79 U），而胞外α-淀粉酶活性略有增加（15-17 U）；胞内支链淀粉酶活性从0.50增至0.80 U，胞外从0.08增至0.12 U。
- 在4%淀粉发酵中，细胞裂解液中葡萄糖和麦芽糖浓度分别为20.5 mM和36.8 mM。
- pC46质粒在P2中96小时稳定性为92%。
研究结论
Klebsiella oxytoca P2(pC46)具有高活性和热稳定性的淀粉水解酶，能够将淀粉直接发酵为乙醇，两步发酵可获得接近理论值90%的乙醇产率，具有作为工业淀粉酶源和产乙醇菌株的潜力。