Modeling Pichia pastoris Growth on Methanol and Optimizing the Production of a Recombinant Protein, the Heavy-Chain Fragment C of Botulinum Neurotoxin, Serotype A
- 作者
- Wenhui Zhang, Mark A. Bevins, Bradley A. Plantz, Leonard A. Smith, Michael M. Meagher
- 单位
- Biological Process Development Facility, Department of Food Science and Technology, University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, Nebraska 68583-0919; United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRID), Fort Detrick, Frederick, Maryland 21702-5012
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2000）
- DOI
- 10.1002/1097-0290(20001005)70:1<1::aid-bit1>3.0.co;2-y
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
建立重组毕赤酵母Mut+以甲醇为碳源的非结构化生长模型，量化甲醇浓度与比生长速率、底物消耗和产物形成的关系，并用于优化肉毒杆菌神经毒素A型重链片段C(BoNT/A(Hc))的生产。
研究策略
通过准稳态补料分批发酵实验，分别在甲醇限制和甲醇过量条件下控制甲醇浓度和比生长速率，测定细胞生长、底物消耗和产物积累数据，拟合非竞争性抑制生长模型和线性比消耗速率方程，建立非结构化模型，再基于模型模拟和优化操作条件。
研究路线图
创新点
(1) 首次建立了描述P. pastoris Mut+在甲醇上生长的非结构模型，明确了甲醇促进和抑制生长的分界浓度；(2) 将产物含量与比生长速率关联，发现最大胞内产物含量出现在约1/3最大比生长速率处；(3) 提出了两种基于氧传递或培养基限制的优化策略，预测最大产量0.77 g/L。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 Mut+ | 甲醇氧化途径 | AOX1 | 醇氧化酶 (alcohol oxidase) | 催化 | 催化甲醇氧化为甲醛，是甲醇代谢关键酶；细胞内积累甲醛和过氧化氢导致甲醇在高浓度下对细胞有毒 |
| Pichia pastoris GS115 Mut+ | 异源蛋白表达途径 | BoNT/A(Hc) | BoNT/A(Hc) (肉毒杆菌神经毒素A型重链片段C) | 调控 | 重组目标蛋白，在AOX1启动子控制下表达；其含量受甲醇浓度和比生长速率影响 |
| Pichia pastoris GS115 Mut+ | 甲醇代谢 | — | — | 能量供给 | 甲醇作为碳源和能源，通过甲醇氧化途径提供能量和代谢前体 |
关键发现
- 模型预测最大比生长速率μ'_m=0.08 h^-1，对应甲醇浓度3.65 g/L
- 实际最大μ_m=0.0709 h^-1，最大甲醇比消耗速率ν_MeOH,m=0.0682 g/g WCW/h。甲醇限制下，ν_MeOH=0.84μ+0.0071，ν_NH3=0.14μ
- 真产率Y_X/MeOH,t=1.19 g WCW/g甲醇，维持系数m_MeOH=0.0071 g/g WCW/h。产物含量α在μ=0.0267 h^-1时达到最大1.72 mg/g WCW，特定产物形成速率ρ在μ=0.0709 h^-1时最大为0.082 mg/g WCW/h。模型预测最大BoNT/A(Hc)产量0.77 g/L，总发酵时间54 h。
研究结论
建立了适用于P. pastoris Mut+菌株的非结构生长模型，能够预测不同甲醇浓度下的生长和产物形成。研究发现最佳产物含量对应的比生长速率约为最大比生长速率的三分之一，说明产物形成与生长速率密切相关。该模型可作为其他重组蛋白生产优化的起点，但产物特异性可能需要调整参数。