Quantification of Metabolites in the Indole Alkaloid Pathways of Catharanthus roseus: Implications for Metabolic Engineering
- 作者
- Jacqueline V. Shanks, Rajiv Bhadra, John Morgan, Sushil Rijhwani, Sundeep Vani
- 单位
- Institute of Biosciences and Bioengineering, Department of Chemical Engineering, Rice University
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（1998）
- DOI
- 10.1002/(sici)1097-0290(19980420)58:2-3<333::aid-bit35>3.0.co;2-a
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
长春花吲哚生物碱代谢工程中缺乏对途径限速步骤的认识，特别是长春蔓花碱合成至文多灵的分支通量调控问题
研究策略
利用毛状根培养体系，结合光适应、前体饲喂和真菌诱导等扰动-响应实验，同时定量多个生物碱以识别通量限制点
研究路线图
创新点
['首次在长春花毛状根中同时定量测定他波宁、荷哈默里辛和洛奇内辛等化合物', '发现毛状根中他波宁向荷哈默里辛和洛奇内辛的通量分流显著大于向文多灵的分流', '采用多组分定量方法揭示光适应对多个生物碱分支的差异化影响', '通过前体饲喂表明萜类途径限速步骤位于牻牛儿醇上游', '用果胶酶、几丁质和茉莉酸等明确诱导子选择性影响不同生物碱分支']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus hairy root clone LBE-6-1 | 萜类吲哚生物碱合成途径 | — | Tryptophan Decarboxylase (TDC) | 催化 | 色氨酸脱羧酶，催化色氨酸产生色胺，已克隆 |
| Catharanthus roseus hairy root clone LBE-6-1 | 萜类吲哚生物碱合成途径 | — | Geraniol 10-hydroxylase (G10H) | 催化 | 推测的萜类分支限速酶，细胞色素P450单加氧酶，尚未克隆 |
| Catharanthus roseus hairy root clone LBE-6-1 | 萜类吲哚生物碱合成途径 | — | NADPH:cytochrome P-450 reductase | 催化 | G10H的辅酶，已克隆 |
| Catharanthus roseus hairy root clone LBE-6-1 | 萜类吲哚生物碱合成途径 | — | Strictosidine Synthase (SSS) | 催化 | 催化色胺与裂环马钱子苷缩合生成马钱子苷，已克隆 |
| Catharanthus roseus hairy root clone LBE-6-1 | tabersonine至vindoline分支 | — | Tabersonine 16-hydroxylase | 催化 | 催化tabersonine生成16-羟基tabersonine，属细胞色素P450单加氧酶，该步在毛状根中可能缺乏或活性低 |
| Catharanthus roseus hairy root clone LBE-6-1 | tabersonine至vindoline分支 | — | N-methyltransferase (NMT) | 催化 | 参与vindoline合成中的N-甲基化，活性与类囊体膜相关，光诱导 |
| Catharanthus roseus hairy root clone LBE-6-1 | tabersonine至lochnericine和hörhammericine分支 | — | — | 催化 | 将tabersonine转化为lochnericine和hörhammericine的酶尚不明确，但造成主要通量分流 |
| Catharanthus roseus hairy root clone LBE-6-1 | 吲哚生物碱合成途径 | — | Peroxidase | 催化 | 催化catharanthine和vindoline偶联生成vinblastine |
| Catharanthus roseus hairy root clone LBE-6-1 | 萜类前体途径 | — | — | 能量供给 | 研究涉及前体饲喂：mevalonic acid, geraniol, 10-hydroxygeraniol, loganin，用于探测萜类途径限速步骤 |
关键发现
['毛状根中荷哈默里辛和洛奇内辛的联合比产率是他波宁的5-15倍', '他波宁水平在培养稳定期下降，而洛奇内辛和荷哈默里辛积累，洛奇内辛积累水平高于他波宁和荷哈默里辛', '光适应培养中ajmalicine和serpentine比产率增加，而他波宁水平较暗培养对照降低', '前体饲喂：loganin使tabersonine增加55%，geraniol使其增加66%，10-hydroxygeraniol使其增加50%，mevalonic acid无显著影响', '果胶酶处理使他波宁水平约为对照的2.5倍，但对其他生物碱无显著影响', '几丁质处理使ajmalicine水平选择性提高50%', '茉莉酸处理使ajmalicine比产率提高80%，serpentine提高60%', '毛状根中ajmalicine最大产量约5 mg/L，serpentine约10 mg/L（3%蔗糖B5/2培养基）', '未检测到vindoline和vinblastine，但检测到akuammine']
研究结论
长春花毛状根中缺少vindoline积累的关键限制在于tabersonine分支点通量被大量分流至lochnericine和hörhammericine，而非tabersonine向vindoline的转化；萜类途径限速步骤位于geraniol上游；光虽可诱导vindoline后期合成酶，但降低根部tabersonine通量。代谢工程应重点改造tabersonine分支点，调控相关酶活性及分子水平。