Cloning and Characterization of the Astaxanthin Biosynthetic Gene Encoding Phytoene Desaturase of Xanthophyllomyces dendrorhous
- 作者
- Jan C. Verdoes, Norihiko Misawa, Albert J. J. van Ooyen
- 单位
- Division of Industrial Microbiology, Department of Food Technology and Nutritional Sciences, Wageningen University and Research Centre, The Netherlands; Central Laboratories for Key Technology, Kirin Brewery Co., Ltd., Japan
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（1999）
- DOI
- 10.1002/(SICI)1097-0290(19990620)63:6<750::AID-BIT13>3.0.CO;2-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从红法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）中克隆并鉴定参与虾青素生物合成的首个基因，即编码八氢番茄红素脱氢酶的crtI基因，并明确其在类胡萝卜素合成途径中的功能，为代谢工程改造虾青素产量奠定基础。
研究策略
通过在大肠杆菌中进行异源互补筛选cDNA文库，从约14,000个菌落中分离得到两个阳性克隆；将带有X. dendrorhous crtI cDNA的质粒与含有E. uredovora crtE和crtB基因的质粒共转化E. coli，利用HPLC分析类胡萝卜素积累，进而鉴定该酶的功能。
研究路线图
核心内容
本研究从红法夫酵母中克隆并鉴定了虾青素生物合成途径中的八氢番茄红素脱氢酶基因crtI。通过在大肠杆菌中构建cDNA文库并进行异源互补筛选，从约14,000个菌落中获得两个阳性克隆，将携带该基因的质粒与来自欧文氏菌的crtE和crtB基因共转化大肠杆菌后，利用HPLC分析类胡萝卜素积累情况。结果显示，该cDNA编码582个氨基酸残基、分子量约65.1 kDa的蛋白质，其编码区含有11个内含子；功能鉴定证明该酶属于crtI型脱氢酶，单基因产物即可催化八氢番茄红素经四步脱氢生成番茄红素，共表达时积累番茄红素144.3 μg/g干重。该研究首次从红法夫酵母中分离出类胡萝卜素合成基因，明确其催化功能及限速可能性，为后续利用代谢工程改造虾青素产量提供了关键靶点。
创新点
首次从X. dendrorhous中分离出类胡萝卜素生物合成基因crtI；发现该基因编码区含有11个内含子；证明其编码的八氢番茄红素脱氢酶属于crtI型，单基因产物即可催化八氢番茄红素经四步脱氢生成番茄红素。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 异源表达来自Xanthophyllomyces dendrorhous的crtI cDNA，可催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | GGPP合酶 | 催化 | 来自Erwinia uredovora，催化GGPP合成，为类胡萝卜素途径提供前体 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Erwinia uredovora，催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 虾青素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 原始来源菌株，该基因编码区含有11个内含子 |
关键发现
- 从约14,000个菌落中筛选到2个黄色/橙色互补克隆（pPRpd1和pPRpd2）
- 互补后产生玉米黄质及其葡萄糖苷，总含量为67 μg/g干重
- 对照中八氢番茄红素为285.4 μg/g干重。共表达pACCRT-EB与pPRpd1时，积累番茄红素144.3 μg/g干重和八氢番茄红素183.5 μg/g干重。cDNA编码582个氨基酸残基的蛋白质，计算分子量为65.1 kDa
- 内含子长度为74-176 nt。野生型X. dendrorhous虾青素产量约为400 μg/g干重。
研究结论
X. dendrorhous的crtI基因编码一个crtI型八氢番茄红素脱氢酶，该单基因产物能够完成从八氢番茄红素到番茄红素的四步脱氢反应，番茄红素是后续环化反应的底物。该酶可能是虾青素生物合成途径的限速步骤，是代谢工程改造的重要靶点。