Novel Enzymatic Approach to the Synthesis of Flavonoid Glycosides and Their Esters
- 作者
- Chunli Gao, Patrick Mayon, David A. MacManus, Evgeny N. Vulfson
- 单位
- Institute of Food Research, Norwich Research Park, Colney, Norwich, NR4 7UA, UK
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2000）
- DOI
- 10.1002/1097-0290(2000)71:3<235::aid-bit1013>3.0.co;2-m
- 所属领域
- 酶工程与生物催化
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
类黄酮（如(+)-儿茶素）在水溶液中溶解度极低，难以作为糖苷酶的受体进行酶法糖基化，且传统反应条件下无产物生成。
研究策略
利用过饱和溶液技术：将类黄酮与糖基供体（对硝基苯基糖苷、麦芽糖、糊精）在聚乙二醇二甲醚存在下加热溶解后冷却，形成稳定的过饱和溶液，提高类黄酮的有效浓度和溶解性，从而实现糖苷酶催化的转糖基反应；随后在有机溶剂中用脂肪酶催化类黄酮糖苷与乙烯基芳基丙酸酯进行区域选择性酯化，两步合成类黄酮糖苷酯。
研究路线图
核心内容
针对类黄酮水溶性极低、难以作为糖苷酶受体进行酶法糖基化的问题，本研究提出利用过饱和溶液技术突破溶解度瓶颈。研究将(+)-儿茶素等类黄酮与糖基供体在聚乙二醇二甲醚存在下加热溶解后冷却，形成稳定过饱和溶液，使(+)-儿茶素溶解度从约10 mg/mL提升至400 mg/mL（提高约40倍），随后使用商品化纤维素酶、α-淀粉酶和α-D-葡萄糖苷酶一步实现类黄酮5、7、4'位的区域选择性糖基化。其中，制备(+)-儿茶素4'-O-β-D-吡喃岩藻糖苷的产率达26%，7-O-和5-O-葡萄糖苷混合物产率为20%。所得糖苷再经Candida antarctica和Mucor miehei来源的脂肪酶催化，在有机溶剂中与乙烯基芳基丙酸酯进行区域选择性酯化，合成类黄酮糖苷酯类衍生物（产率15%~70%）。该两步法利用廉价商品化酶即可高效组装复杂的类黄酮糖苷酯，为这类天然产物的简便制备提供了可行方案。
创新点
['首次将过饱和溶液反应用于类黄酮的酶法糖基化，解决了其溶解度瓶颈', "一步反应即可在类黄酮的5、7、4'位实现区域选择性糖基化，使用廉价商品化糖苷酶", '通过连续使用糖苷酶和脂肪酶，仅两步即可组装复杂的类黄酮糖苷酯']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| — | 类黄酮糖基化 | — | 纤维素酶 (cellulase, EC 3.2.1.4, 来自 Aspergillus niger) | 催化 | 催化(+)-儿茶素与对硝基苯基-β-D-吡喃岩藻糖苷的转糖基反应，生成4'-O-β-D-吡喃岩藻糖苷 |
| — | 类黄酮糖基化 | — | α-淀粉酶 (α-amylase, EC 3.2.1.1, 来自 Bacillus sp.) | 催化 | 催化(+)-儿茶素与糊精的转糖基反应，生成7-O-和5-O-α-D-麦芽糖苷 |
| — | 类黄酮糖基化 | — | α-D-葡萄糖苷酶 (α-D-glucosidase, EC 3.2.1.20, 来自 Bacillus stearothermophilus) | 催化 | 催化(+)-儿茶素与麦芽糖的转糖基反应，生成7-O-和5-O-α-D-吡喃葡萄糖苷 |
| — | 类黄酮酯化 | — | 脂肪酶 Novozyme 435 (来自 Candida antarctica) | 催化 | 催化类黄酮糖苷与乙烯基肉桂酸酯/阿魏酸酯/香豆酸酯的酯化反应，活性最高，反应在叔丁醇/吡啶（9:1）或乙腈/吡啶（9:1）中进行 |
| — | 类黄酮酯化 | — | 脂肪酶 Lipozyme IM (来自 Mucor miehei) | 催化 | 也能催化酯化反应，但转化率较Novozyme 435低 |
关键发现
- ['(+)-儿茶素在柠檬酸缓冲液中37°C溶解度仅约10 mg/mL，但在过饱和溶液中可达到400 mg/mL（即0.4 g/mL），溶解度提高约40倍', '对硝基苯基-β-D-吡喃岩藻糖苷在过饱和溶液中浓度可达200 mg/mL（基础溶解度约4 mg/mL），提高约50倍', "制备(+)-儿茶素4'-O-β-D-吡喃岩藻糖苷的产率为26%（基于对硝基苯基-β-D-吡喃岩藻糖苷）", '制备(+)-儿茶素7-O-α-D-吡喃葡萄糖苷与5-O-α-D-吡喃葡萄糖苷混合物的产率为20%（基于麦芽糖）', '制备(+)-儿茶素7-O-α-D-麦芽糖苷与5-O-α-D-麦芽糖苷混合物的产率为5%（w/w，基于糊精）', "酯化反应中，6''-O-((+)-儿茶素-7-O-α-D-吡喃葡萄糖苷)肉桂酸酯的制备产率为70%", "异槲皮苷6''-O-肉桂酸酯产率45%，6''-O-香豆酸酯产率32%，6''-O-阿魏酸酯产率15%", "柚皮苷6''-O-阿魏酸酯产率25%，6''-O-香豆酸酯产率30%，6''-O-肉桂酸酯产率30%", "木犀草素7-O-(6''-肉桂酰)-β-D-吡喃葡萄糖苷产率30%", '脂肪酶催化酯化的反应活性顺序为：乙烯基肉桂酸酯 > 乙烯基阿魏酸酯 > 乙烯基香豆酸酯
- 含伯羟基的糖苷更容易被酰化，而6-脱氧糖苷（如岩藻糖苷）反应性很差']
研究结论
研究证明，通过形成过饱和溶液可显著提高类黄酮在酶反应中的有效浓度，使商品化糖苷酶能高效催化类黄酮糖基化，一步获得目标糖苷（最高产率26%）。随后用脂肪酶（来自Candida antarctica和Mucor miehei）在有机溶剂中可对糖基进行区域选择性酰化，合成芳基丙酸酯衍生物。两步法利用商品化酶即可组装复杂的类黄酮糖苷酯，为这类天然产物的简便制备提供了可行性方案。