Physiological Studies in Aerobic Batch Cultivations of Saccharomyces cerevisiae Strains Harboring the MEL1 Gene
- 作者
- Simon Ostergaard, Christophe Roca, Birgitte Rønnow, Jens Nielsen, Lisbeth Olsson
- 单位
- Center for Process Biotechnology, Department of Biotechnology, Technical University of Denmark; Danisco Biotechnology, Danisco A/S
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2000）
- DOI
- 10.1002/(sici)1097-0290(20000505)68:3<252::aid-bit3>3.0.co;2-k
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
使工业酿酒酵母菌株能够利用蜜二糖（melibiose），并减轻葡萄糖阻遏对半乳糖代谢的影响，以提高工业过程中糖的利用效率。
研究策略
通过经典育种和基因工程将MEL1基因导入多倍体工业菌株DGI 342，并利用MIG1和GAL80基因破坏部分解除葡萄糖阻遏，比较不同菌株在葡萄糖-半乳糖混合物及蜜二糖上的生理特性。
研究路线图
核心内容
该研究以工业多倍体酿酒酵母DGI 342为底盘，通过经典育种与基因工程导入MEL1基因使其获得蜜二糖水解能力，并利用MIG1和GAL80基因破坏部分解除葡萄糖阻遏，构建了M24、T200、T256和TH1等多种菌株，比较其在葡萄糖-半乳糖混合物及蜜二糖上的生理特性。结果显示所有菌株对葡萄糖的最大比摄取速率比半乳糖高2.5至3.3倍，半乳糖上生物量产率则为葡萄糖的1.8至2.7倍。在葡萄糖-半乳糖混合物中，野生型DGI 342从葡萄糖耗竭到半乳糖耗竭需要6小时，而TH1缩短至不足3小时，缩短约45%。TH1因多拷贝组成型表达MEL1，蜜二糖水解速率达0.24 C-mol/g/h，乙醇产率为0.33 C-mol/C-mol，均显著高于低水解速率的T200和T256，后者却获得更高的生物量产率。这一结果表明，将MEL1导入多倍体工业菌株并破坏MIG1和GAL80可有效加快混合糖的共利用，提升蜜二糖的转化效率，为工业酵母利用复杂底物提供了可行策略。
创新点
构建了多种蜜二糖水解酿酒酵母菌株（M24、T200、T256、TH1），其中TH1通过破坏MIG1和GAL80并多拷贝表达MEL1，实现了部分同时利用葡萄糖和半乳糖，并具有极高的蜜二糖水解速率。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae DGI 342 | 蜜二糖水解/半乳糖利用 | MEL1 | Mel1p (melibiase, α-半乳糖苷酶) | 催化 | 编码胞外蜜二糖酶，水解蜜二糖为葡萄糖和半乳糖 |
| Saccharomyces cerevisiae DGI 342 | 葡萄糖阻遏信号通路 | MIG1 | Mig1 | 调控 | 葡萄糖阻遏相关转录因子，TH1中破坏以解除对GAL基因的阻遏 |
| Saccharomyces cerevisiae DGI 342 | 半乳糖代谢调控 | GAL80 | Gal80 | 调控 | Gal4的抑制蛋白，TH1中破坏以减轻对GAL基因的抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae DGI 342 | 半乳糖代谢调控 | GAL4 | Gal4 | 调控 | 转录激活因子，调控GAL基因和MEL1的表达 |
| Saccharomyces cerevisiae DGI 342 | 半乳糖转运 | GAL2 | Gal2 | 转运 | 半乳糖透性酶，负责半乳糖的转运 |
| Saccharomyces cerevisiae DGI 342 | 葡萄糖代谢 | HXK2 | Hxk2 | 催化 | 己糖激酶同工酶，T256中作为MEL1整合位点 |
| Saccharomyces cerevisiae DGI 342 | 氨基酸生物合成 | LEU2 | Leu2 | 催化 | β-异丙基苹果酸脱氢酶，T200中作为MEL1整合位点 |
| Saccharomyces cerevisiae DGI 342 | 糖酵解途径 | — | — | 能量供给 | 通过糖酵解和呼吸作用提供能量，葡萄糖代谢中因Crabtree效应产生乙醇 |
关键发现
- 所有菌株在葡萄糖上的最大比摄取速率比半乳糖高2.5-3.3倍
- 葡萄糖上乙醇产率显著高于半乳糖，而半乳糖上生物量产率是葡萄糖的1.8-2.7倍。T200和T256的蜜二糖水解速率分别为0.04和0.03 C-mol/g/h，生物量产率高达约10 g/C-mol
- M24和TH1的水解速率分别为0.17和0.24 C-mol/g/h，TH1在蜜二糖上的乙醇产率达0.33 C-mol/C-mol，而M24为0.16。在葡萄糖-半乳糖混合物中，野生型DGI 342从葡萄糖耗竭到半乳糖耗竭的时间为6小时，TH1缩短至不足3小时（45%），M24缩短30%
- TH1在蜜二糖上最大比生长速率为0.25 h-1，M24为0.32 h-1，T200为0.28 h-1，T256为0.25 h-1。
研究结论
将MEL1基因导入多倍体工业酿酒酵母菌株DGI 342可使其利用蜜二糖。破坏MIG1和GAL80基因能有效缩短葡萄糖与半乳糖的消耗间隔，TH1菌株因多拷贝组成型表达MEL1而获得最高的蜜二糖水解速率和乙醇产率，而低水解速率的T200和T256则获得更高的生物量产率。