Simultaneous overexpression of enzymes of the lower part of glycolysis can enhance the fermentative capacity of Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Hans Peter Smits, Jörg Hauf, Susanne Müller, Timothy J. Hobley, Friedrich K. Zimmermann, Bärbel Hahn-Hägerdal, Jens Nielsen, Lisbeth Olsson
- 单位
- Center for Process Biotechnology, Department of Biotechnology, Technical University of Denmark; Department of Applied Microbiology, University of Lund; Institut für Genetik, Technische Universität Darmstadt
- 杂志
- Yeast（2000）
- DOI
- 10.1002/1097-0061(200010)16:14<1325::AID-YEA627>3.0.CO;2-E
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
同时过表达糖酵解下半部分多个酶是否能够提高酿酒酵母的糖酵解通量和发酵能力
研究策略
利用截短的HXT7启动子同时过表达糖酵解下半部分的7个酶（甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶），构建重组菌株YHM4和YHM7，比较其在葡萄糖批培养、混合糖厌氧批培养、恒化培养及葡萄糖脉冲条件下的生理特性，通过二氧化碳产生速率变化评估发酵能力
研究路线图
核心内容
该研究利用截短的HXT7启动子，在酿酒酵母中同时过表达糖酵解下半部分的7个酶（从甘油醛-3-磷酸脱氢酶到乙醇脱氢酶），构建了重组菌株YHM4和YHM7，以考察多酶协同过表达对糖酵解通量和发酵能力的影响。结果显示，在葡萄糖生长时各酶活性较宿主菌提高1.1至3.4倍，其中磷酸甘油酸变位酶升幅最大；但在常规批培养中，重组菌株最大比生长速率（0.27–0.38 h⁻¹）低于宿主菌（0.41 h⁻¹），乙醇产率也无明显提升。关键差异出现在葡萄糖脉冲实验中：宿主菌的二氧化碳产生速率加速度为6×10⁻³ mmol/g/min²，而YHM7达到12×10⁻³ mmol/g/min²，即发酵能力提升约2倍。代谢物分析显示葡萄糖-6-磷酸和果糖-1,6-二磷酸水平未因下糖酵解酶过表达而耗竭。该结果表明，仅当细胞ATP需求急剧增强时，过量表达整套下糖酵解酶才能显著提高发酵通量，正常培养条件下糖酵解通量受产物需求控制，且蛋白过表达负担可能抵消潜在增益，提示代谢工程改造需考虑动态需求和蛋白成本。
创新点
首次同时过表达糖酵解下半部分的完整酶序列（7个酶），而非单个或少数几个酶；采用截短的HXT7启动子驱动表达；通过葡萄糖脉冲增加ATP需求来揭示过量表达酶对发酵能力的影响
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK.K45, YHM4, YHM7) | 糖酵解（下半部分） | TDH3 | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) | 催化 | 编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶，过表达后酶活性升高 |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK.K45, YHM4, YHM7) | 糖酵解（下半部分） | PGK1 | 磷酸甘油酸激酶 | 催化 | 编码磷酸甘油酸激酶，过表达后酶活性升高 |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK.K45, YHM4, YHM7) | 糖酵解（下半部分） | GPM1 | 磷酸甘油酸变位酶 | 催化 | 编码磷酸甘油酸变位酶，过表达后酶活性升高最多（葡萄糖生长时3.4倍） |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK.K45, YHM4, YHM7) | 糖酵解（下半部分） | ENO2 | 烯醇酶 | 催化 | 编码烯醇酶，过表达后酶活性升高 |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK.K45, YHM4, YHM7) | 糖酵解（下半部分） | PYK1 | 丙酮酸激酶 | 催化 | 编码丙酮酸激酶，过表达后酶活性升高 |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK.K45, YHM4, YHM7) | 糖酵解（下半部分） | PDC1 | 丙酮酸脱羧酶 | 催化 | 编码丙酮酸脱羧酶，过表达后酶活性升高最少（1.1倍） |
| Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK.K45, YHM4, YHM7) | 糖酵解（下半部分） | ADH1 | 乙醇脱氢酶 | 催化 | 编码乙醇脱氢酶，过表达后酶活性升高 |
关键发现
- 在葡萄糖生长时，重组菌株YHM4和YHM7中糖酵解酶活性比宿主菌CEN.PK.K45高1.1-3.4倍，其中磷酸甘油酸变位酶活性升高最多（3.4倍），丙酮酸脱羧酶活性升高最少（1.1倍）
- 在乙醇生长时，酶活性升高1.2-16倍。在葡萄糖脉冲实验中，CEN.PK.K45的qCO2加速度为6×10^-3 mmol/g/min^2，而YHM7为12×10^-3 mmol/g/min^2，即重组菌株的二氧化碳产生速率加速快2倍，表明其发酵能力更高。在批培养中，重组菌株的最大比生长速率（0.27-0.38 h^-1）低于宿主菌（0.41 h^-1），但乙醇产率相近（约1.0 g/g/h好氧，1.5-1.6 g/g/h厌氧）。葡萄糖-6-磷酸和果糖-1,6-二磷酸水平在重组菌株和宿主菌中相似，表明下糖酵解酶过表达未导致上糖酵解代谢物耗竭。
研究结论
同时过表达糖酵解下半部分的全部酶仅在细胞ATP需求增强时（如葡萄糖脉冲）才能显著提高发酵能力，而在正常批培养和恒化培养条件下糖酵解通量并未增加，说明糖酵解通量受产物需求的调控，且过表达带来的蛋白负担可能抵消潜在的通量提升效果。