Metabolic Engineering of the Nonmevalonate Isopentenyl Diphosphate Synthesis Pathway in Escherichia coli Enhances Lycopene Production
- 作者
- Seon-Won Kim, J. D. Keasling
- 单位
- Marine Bioproducts Engineering Center, Department of Chemical Engineering, University of California, Berkeley, CA 94720-1462
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2001）
- DOI
- 10.1002/1097-0290(20000220)72:4<408::aid-bit1003>3.0.co;2-h
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌中番茄红素产量受限于非甲羟戊酸途径中异戊烯基二磷酸（IPP）前体的供应，特别是DXP合酶催化的第一步反应可能为限速步骤。
研究策略
在大肠杆菌中过表达非甲羟戊酸途径的dxs和dxr基因，利用不同启动子（trc、lac、araBAD）和不同拷贝数载体（pTrc99A、pBluescript、pBAD24）优化表达水平，并比较不同宿主菌株对番茄红素产量的影响。
研究路线图
核心内容
该研究通过代谢工程手段系统优化大肠杆菌非甲羟戊酸（MEP）途径中异戊烯基二磷酸（IPP）前体的供给，以提升番茄红素产量。研究者在不同启动子（trc、lac、araBAD）和不同拷贝数载体（pTrc99A、pBluescript、pBAD24）背景下分别过表达MEP途径关键基因dxs和dxr，并在DH5α、XL1-Blue和JM101等宿主菌株中比较番茄红素积累水平。结果显示，阿拉伯糖诱导的P_BAD启动子中等拷贝质粒pBAD24为最优表达系统，单独过表达dxs在13.3 mM阿拉伯糖诱导下使番茄红素产量达到12.3 mg/L，约为对照的4倍；其时间进程实验最高产量达22 mg/L，约为对照的6倍。共表达dxs和dxr在低浓度阿拉伯糖（0–1.33 mM）条件下比单独dxs产量提高1.4–2.0倍，但高浓度下反而抑制产量。结果证明DXP合酶（dxs）是MEP途径中控制IPP通量的限速酶，优化其表达强度并合理选择载体与启动子可显著提升番茄红素合成效率。该研究为类异戊二烯化合物的微生物生产提供了重要的代谢工程策略参考。
创新点
系统比较了不同启动子和载体对dxs/dxr表达及番茄红素产量的影响，发现阿拉伯糖诱导的P_BAD启动子中等拷贝质粒pBAD24是最优表达系统；首次证明dxs是非甲羟戊酸途径的限速步骤，并发现dxr在低诱导剂浓度下可协同提高产量。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 非甲戊酸途径（MEP） | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXP synthase） | 催化 | 催化丙酮酸与甘油醛-3-磷酸缩合生成DXP，是途径的限速步骤 |
| Escherichia coli DH5α | 非甲戊酸途径（MEP） | dxr | DXP还原异构酶（DXP reductoisomerase） | 催化 | 催化DXP还原重排为MEP，在低诱导浓度下与dxs共表达可提高产量 |
| Escherichia coli DH5α、XL1-Blue、JM101 | 番茄红素合成途径 | crtE | GGPP合酶 | 催化 | 来自Erwinia herbicola，催化法尼基二磷酸转化为牻牛儿基牻牛儿基二磷酸 |
| Escherichia coli DH5α、XL1-Blue、JM101 | 番茄红素合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Erwinia herbicola，催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli DH5α、XL1-Blue、JM101 | 番茄红素合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Erwinia herbicola，催化八氢番茄红素去饱和生成番茄红素 |
| Escherichia coli DH5α、XL1-Blue、JM101 | IPP代谢 | ipi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 来自Haematococcus pluvialis，催化IPP与DMAPP的异构化 |
关键发现
- 过表达dxs显著提高番茄红素产量：pDdxs（P_BAD启动子）在13.3 mM阿拉伯糖诱导下产量达12.3 mg/L，是对照的4倍
- pBdxs（lac启动子）使产量提高3.5倍
- pTdxs（trc启动子）未诱导时提高2倍
- 共表达dxs和dxr在0-1.33 mM阿拉伯糖下比单独dxs产量高1.4-2.0倍，但高浓度下反而降低
- 时间进程实验最高产量达22 mg/L，约为对照的6倍
- 菌株比较中XL1-Blue和DH5α产量显著高于JM101。
研究结论
DXP合酶（dxs）是非甲戊酸途径中控制IPP通量的限速酶，通过优化dxs表达可有效提高大肠杆菌中番茄红素的产量；表达载体和启动子的选择对平衡代谢负担至关重要，阿拉伯糖诱导的P_BAD启动子中等拷贝质粒是实现高产的最佳方案。