Isoprenoid Biosynthesis through the Methylerythritol Phosphate Pathway: The (E)-4-Hydroxy-3-methylbut-2-enyl Diphosphate Synthase (GcpE) is a [4Fe-4S] Protein
- 作者
- Myriam Seemann, Bernadette Tse Sum Bui, Murielle Wolff, Denis Tritsch, Narciso Campos, Albert Boronat, Andree Marquet, Michel Rohmer
- 单位
- Universite Louis Pasteur, UMR 7123 CNRS, Institut Le Bel; Universite Paris VI, UMR 7613 CNRS; Universitat de Barcelona, Departement de Bioquimica i Biologia Molecular, Facultat de Quimica
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2002）
- DOI
- 10.1002/1521-3773(20021115)41:22<4337::AID-ANIE4337>3.0.CO;2-K
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明MEP途径最后步骤中GcpE酶的性质及其催化机制，特别是其辅基和还原需求。
研究策略
克隆并表达His标签的GcpE蛋白，纯化后在厌氧条件下重建铁硫簇，通过UV/Vis光谱和铁含量分析表征，并利用不同还原系统（flavodoxin/flavodoxin reductase/NADPH和5-脱氮黄素半醌）测定其催化活性。
研究路线图
核心内容
该研究通过在大肠杆菌中克隆表达His标签的GcpE蛋白，纯化后在厌氧条件下重建铁硫簇，并利用多种还原系统测定其催化活性，阐明了MEP途径最后步骤中GcpE酶的性质。研究发现，纯化的GcpE蛋白纯度达95%，分子量约43 kDa，每个GcpE分子含4.4个铁离子，UV/Vis光谱在410 nm处有特征吸收峰，证明其为[4Fe-4S]铁硫蛋白。在flavodoxin/flavodoxin reductase/NADPH还原体系下，纯化酶可在4小时内将底物环二磷酸7定量转化为HMBPP 8，而粗细胞提取物仅达4-50%转化率；使用5-脱氮黄素半醌体系则可在15分钟内实现定量转化。这一结果表明，GcpE是依赖[4Fe-4S]簇的酶，催化反应需要还原剂并涉及双单电子转移，其铁硫簇的氧敏感性可能是此前研究失败的原因。该发现解决了MEP途径最后一个瓶颈，为异戊二烯类化合物的生物合成研究奠定了基础。
创新点
首次证明GcpE蛋白是[4Fe-4S]铁硫蛋白，并确定了其活性需要铁硫簇重建和还原系统。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | MEP途径 | gcpE (ispG) | GcpE (His-GcpE) | 催化 | 含[4Fe-4S]簇，催化环二磷酸7转化为HMBPP 8 |
| Escherichia coli | MEP途径 | — | Flavodoxin | 能量供给 | 提供还原力（电子传递），与flavodoxin reductase和NADPH组成还原系统 |
| Escherichia coli | MEP途径 | — | Flavodoxin reductase | 能量供给 | 催化NADPH还原flavodoxin，参与还原系统 |
关键发现
- His-GcpE纯化后纯度为95%，分子量约43 kDa
- 重建铁硫簇后每个GcpE分子含4.4个铁离子，UV/Vis光谱在410 nm有特征吸收峰
- 在flavodoxin/flavodoxin reductase/NADPH还原体系下，纯化酶可在4小时内将底物环二磷酸7定量转化为HMBPP 8，而粗细胞提取物仅4-50%转化率
- 用5-脱氮黄素半醌体系在15分钟内即可定量转化。
研究结论
GcpE是依赖[4Fe-4S]簇的酶，催化MEP途径中2-甲基赤藓醇-2,4-环二磷酸（7）转化为(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸（HMBPP，8），反应需要还原剂并涉及双单电子转移；这是MEP途径最后一个瓶颈的解决，其铁硫簇的氧敏感性可能是此前研究失败的原因。