Terpenoid cyclases: design and function of electrophilic catalysts
- 作者
- David E. Cane
- 单位
- Department of Chemistry, Brown University, Providence, RI 02912, USA
- 杂志
- Ciba Foundation Symposium 171: Secondary metabolites: their function and evolution（1992）
- DOI
- 10.1002/9780470514344.ch10
- 所属领域
- 萜类生物合成/酶催化
- 关键词
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解决的核心问题
理解萜类环化酶如何催化无环前体法尼基焦磷酸（FPP）和香叶基焦磷酸（GPP）环化为多种萜类化合物的结构基础与催化机制，包括底物结合、碳正离子中间体的稳定以及产物特异性的决定因素。
研究策略
综合运用立体标记底物、底物/中间体类似物抑制动力学、异常底物环化、基因克隆表达及定点突变等方法，剖析环化酶活性位点的构象约束和电催化机制。
研究路线图
核心内容
该研究综合运用立体标记底物、底物与中间体类似物抑制动力学、异常底物环化、基因克隆表达及定点突变等手段，系统剖析了萜类环化酶催化法尼基焦磷酸（FPP）和香叶基焦磷酸（GPP）环化的结构基础与电催化机制。研究发现，所有萜类环化酶均为可溶性、中等疏水性蛋白，以Mg²⁺或Mn²⁺为唯一辅因子。关键结果包括：将trichodiene synthase保守精氨酸突变为赖氨酸使环化活性降低98%，突变为谷氨酸仅保留0.1%活性，证明该残基对催化至关重要；利用异常底物6,7-二氢FPP（竞争性抑制常数Ki为0.15 μM，而FPP的Km为3.0 μM）揭示了被掩蔽的环化中间步骤，并支持香叶烯A作为正常中间体的假设；铵离子类似物单独仅为弱抑制剂，但加入无机焦磷酸盐后成为强竞争性抑制剂，且pentalenene与焦磷酸盐共同存在可使FPP表观Km增加7倍，提示焦磷酸根基团在稳定碳正离子中间体中发挥关键作用。基于上述证据，该研究提出环化酶活性位点的宽松模型，即产物特异性主要由底物折叠方式和每一步化学转化决定，而非酶对特定构象的严格锁定。
创新点
提出环化酶活性位点的宽松模型（permissive model）；发现无机焦磷酸盐与铵离子类似物对环化酶抑制的协同效应；利用异常底物6,7-二氢FPP揭示被掩盖的环化中间步骤；通过定点突变鉴定保守精氨酸残基的关键催化作用。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| — | 倍半萜生物合成 | — | Trichodiene synthase | 催化 | 来源于Fusarium sporotrichioides和Gibberella pulicaris，催化FPP环化为trichodiene；含保守碱性序列DRRYR/DHRYR和天冬氨酸丰富区VLDDSKD/VLDDSSD。 |
| — | 倍半萜生物合成 | — | Aristolochene synthase | 催化 | 来源于Aspergillus terreus（近60 kDa）和Penicillium roqueforti（近40 kDa），催化FPP经germacrene A环化为aristolochene；含有相关七肽LIDDVLE。 |
| — | 倍半萜生物合成 | — | epi-Aristolochene synthase | 催化 | 来源于烟草(Nicotiana tabacum)细胞培养物，催化FPP生成epi-aristolochene，与aristolochene synthase机制相似但底物折叠立体化学不同。 |
| — | 倍半萜生物合成 | — | Pentalenene synthase | 催化 | 来源于链霉菌(Streptomyces)，催化FPP环化为pentalenene；初步测序未发现与trichodiene synthase同源的碱性富集序列。 |
关键发现
- ['所有已研究的萜类环化酶为可溶性、中等疏水性蛋白，亚基相对分子量40,000-65,000（摘要中表述为40,000-100,000），需要二价金属离子（通常为Mg2+或Mn2+）作为唯一辅因子。', '将Fusarium sporotrichioides trichodiene synthase的保守精氨酸（DRRYR中的R）突变为赖氨酸，环化活性降低98%
- 突变为谷氨酸则仅保留0.1%的活性。', '铵离子类似物（bisabolyl cation的氮杂类似物(R)-5和(S)-5）单独存在时仅为弱抑制剂，但在加入无机焦磷酸盐后成为强竞争性抑制剂，且两种对映体行为相同
- α-terpinyl阳离子类似物(R)-和(S)-6结合亲和力比(R)-5弱4-8倍
- 三甲铵离子(7)又弱约10倍。', '6,7-二氢FPP (10) 对aristolochene synthase的竞争性抑制常数Ki为0.15 μM，而FPP的Km为3.0 μM。', 'pentalenene与无机焦磷酸盐（各10 μM）共同存在时，可使FPP的表观Km增加7倍，而单独存在时均无明显抑制。', 'aristolochene synthase和epi-aristolochene synthase可将异常底物6,7-二氢FPP转化为二氢香叶烯A的同分异构体（分子量206 Da），支持了香叶烯A作为正常环化中间体的假设。', 'trichodiene synthase基因在E. coli中表达后，能利用内源FPP产生trichodiene
- 近期进一步实现高表达，达到总蛋白的15-25%。', '从20-30升Streptomyces培养物中仅能纯化100-200 pmol的pentalenene synthase，表明环化酶天然表达量极低。']
研究结论
萜类环化酶通过结合并折叠无环底物，电离烯丙基二磷酸引发环化，并在单个活性位点内稳定一系列碳正离子中间体，最终引导形成特定环化产物。环化酶活性位点具有较大的构象容忍性（宽松模型），产物特异性主要由底物折叠和每一步化学转化决定；无机焦磷酸根基团在中间体稳定中可能发挥重要作用。