Novel triterpene oxidizing activity of Arabidopsis thaliana CYP716A subfamily enzymes
- 作者
- Shuhei Yasumoto, Ery O. Fukushima, Hikaru Seki, Toshiya Muranaka
- 单位
- Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka University; Frontier Research Base for Global Young Researchers, Graduate School of Engineering, Osaka University
- 杂志
- FEBS Letters（2016）
- DOI
- 10.1002/1873-3468.12074
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析拟南芥CYP716A亚家族酶CYP716A1和CYP716A2对三萜骨架的氧化功能，并发现新颖的催化活性，为三萜类化合物的组合生物合成提供新酶。
研究策略
在产生α-amyrin、β-amyrin和lupeol的酵母工程菌株中异源表达CYP716A1和CYP716A2，通过GC-MS及NMR分析氧化产物，鉴定其催化活性。
研究路线图
核心内容
本研究在酿酒酵母中异源表达了拟南芥CYP716A亚家族的CYP716A1和CYP716A2，分别以α-amyrin、β-amyrin和lupeol为底物，通过GC-MS和NMR鉴定氧化产物。结果显示，两种酶均能催化三种三萜底物的C-28位羟基化，分别生成uvaol、erythrodiol和betulin，但仅CYP716A1能进一步将α-amyrin和β-amyrin氧化为ursolic acid和oleanolic acid。值得注意的是，CYP716A2对α-amyrin展现出新颖的22α-羟基化活性，产物经NMR确定为22α-羟基-α-amyrin，对β-amyrin也有类似活性（推测），而对lupeol仅催化单步羟基化。从约7L酵母培养物中纯化获得3.6mg该新颖产物。此外，研究纠正了TAIR数据库中CYP716A2的注释，证明其由At5g36130和At5g36140共同编码。该发现首次报道CYP716A亚家族具有22α-羟基化活性，为利用拟南芥等非药用植物发掘新颖三萜氧化酶、丰富组合生物合成工具箱提供了依据，有助于生产具有生物活性的稀有三萜化合物。
创新点
首次报道CYP716A亚家族酶具有22α-羟基化活性（CYP716A2催化α-amyrin生成22α-羟基-α-amyrin）；纠正了TAIR数据库中CYP716A2的错误注释，证明CYP716A2由At5g36130和At5g36140共同编码；表明拟南芥这类非药用植物也可作为新颖三萜氧化酶的来源。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成 | CYP716A1 | CYP716A1 | 催化 | 催化α-amyrin、β-amyrin和lupeol的C-28羟基化，并能进一步氧化α-amyrin和β-amyrin的C-28位生成羧酸 |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成 | CYP716A2 | CYP716A2 | 催化 | 催化α-amyrin和β-amyrin的C-28羟基化及22α-羟基化，对lupeol仅催化C-28羟基化生成betulin |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成 | aAS | α-amyrin synthase | 催化 | 环化2,3-氧化鲨烯生成α-amyrin，为CYP716A提供底物 |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成 | bAS | β-amyrin synthase | 催化 | 环化2,3-氧化鲨烯生成β-amyrin，为CYP716A提供底物 |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成 | LUS | lupeol synthase | 催化 | 环化2,3-氧化鲨烯生成lupeol，为CYP716A提供底物 |
| Arabidopsis thaliana | 三萜生物合成 | CYP716A1/At5g36110, CYP716A2/At5g36130+At5g36140 | CYP716A1, CYP716A2 | 催化 | 基因来源；CYP716A2在TAIR中被错误注释为两个基因，本研究证明其转录为一个完整P450 |
关键发现
- CYP716A1和CYP716A2均能催化α-amyrin、β-amyrin和lupeol的C-28羟基化，分别生成uvaol、erythrodiol和betulin
- 但仅CYP716A1能进一步催化α-amyrin和β-amyrin的C-28氧化生成ursolic acid和oleanolic acid。CYP716A2对α-amyrin具有新颖的22α-羟基化活性，产物经NMR鉴定为22α-羟基-α-amyrin。CYP716A2对β-amyrin也表现出22α-羟基化活性（推测）。CYP716A1和CYP716A2对lupeol仅催化单步羟基化生成betulin，未生成betulinic acid。CYP716A1全长477个氨基酸，CYP716A2全长473个氨基酸，两者同源性为83.7%。从约7L酵母培养物中纯化获得3.6mg化合物4（22α-羟基-α-amyrin）。
研究结论
拟南芥CYP716A1和CYP716A2具有三萜氧化活性，其中CYP716A2表现出新颖的22α-羟基化活性，可用于组合生物学生产具有生物活性的稀有三萜。该研究为从非药用植物中发现有用酶提供了依据，并有助于丰富三萜生物合成的分子工具箱。