Deletion of the Gly600 Residue of Alicyclobacillus acidocaldarius Squalene Cyclase Alters the Substrate Specificity into that of the Eukaryotic-Type Cyclase Specific to (3S)-2,3-Oxidosqualene
- 作者
- Tsutomu Hoshino, Kunio Shimizu, Tsutomu Sato
- 单位
- Department of Applied Biological Chemistry Faculty of Agriculture and Graduate School of Science and Technology Niigata University, Ikarashi, Niigata 950-2181, Japan
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2004）
- DOI
- 10.1002/anie.200461523
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究细菌角鲨烯环化酶中高度保守的 Gly600 残基对底物特异性的影响，探究原核环化酶能否通过单点缺失突变变为真核型环化酶，仅识别(3S)-2,3-氧化角鲨烯。
研究策略
通过 PCR 定点缺失构建 ΔG600 突变体（删除 Gly600 残基），将突变酶分别与角鲨烯及(3S)/(3R)-氧化角鲨烯的消旋体共孵育，采用 GC、NMR 等分析产物结构和立体化学，比较突变体与野生型的底物特异性和催化活性。
研究路线图
核心内容
该研究通过定点缺失突变，将来源于嗜酸热脂环芽孢杆菌的细菌型角鲨烯环化酶（SHC）中高度保守的Gly600残基删除，构建了ΔG600突变体，以探究原核环化酶底物特异性能否转变为真核型。突变酶分别与角鲨烯及(3S)/(3R)-2,3-氧化角鲨烯消旋体共孵育后，经GC和NMR分析产物结构与立体化学。结果显示，ΔG600突变体对角鲨烯和(3R)-异构体的环化活性低于检测限（<0.2%），仅能识别(3S)-2,3-氧化角鲨烯，转化率为64%，总产物产率32%，产物为3β-羟基单环或三环三萜，其中两个为新化合物，而底物回收率达68%。突变体对(3S)-底物的比活力为26.8 nmol min⁻¹ mg⁻¹，较野生型的234.0下降约10倍。该工作首次实现了将原核角鲨烯环化酶的底物专一性转换为真核型，Gly600的缺失改变了催化腔结构并影响环化终止步骤，为理解真核环化酶底物识别机制提供了关键结构基础，也提示可通过理性突变设计具有真核型特异性的环化酶。
创新点
首次实现将原核角鲨烯环化酶的底物特异性转变为真核型：ΔG600 突变体只识别(3S)-2,3-氧化角鲨烯，完全不能环化角鲨烯和(3R)-异构体；且产物从五环三萜变为单环/三环骨架，表明 Gly600 缺失改变催化腔结构和环化终止步骤。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| — | 三萜生物合成（角鲨烯环化） | shc | Squalene-hopene cyclase (SHC)，ΔG600 突变体（删除 Gly600） | 催化 | 来自 Alicyclobacillus acidocaldarius，催化角鲨烯环化为五环三萜；突变后底物特异性变为只识别 (3S)-2,3-氧化角鲨烯，产物为单环/三环 3β-羟基化合物 |
关键发现
- ΔG600 突变体对角鲨烯 (1) 和 (3R)-2,3-氧化角鲨烯 (7) 的环化活性低于检测限 (<0.2%)；对 (3S)-2,3-氧化角鲨烯 (4) 的转化率为 64%，总产物产率 32%，产物 10-15 的分布比为
- 3:2.9:2.9:3.4:8.6:2.9，底物回收 68%；产物均为 3β-羟基单环或三环三萜，其中 12 和 15 为新化合物。突变体对 4 的比活力为
- 8 nmol min⁻¹ mg⁻¹，野生型为
- 0，活性下降约 10 倍。
研究结论
研究表明，删除 Gly600 可将细菌角鲨烯环化酶的底物特异性转变为真核型，仅识别(3S)-2,3-氧化角鲨烯，为理解真核环化酶的底物专一性提供了新见解，并可能通过理性突变进一步创制真核型环化酶。