High-Throughput Screening for Terpene-Synthase-Cyclization Activity and Directed Evolution of a Terpene Synthase
- 作者
- Ryan Lauchli, Kersten S. Rabe, Karolina Z. Kalbarczyk, Amulya Tata, Thomas Heel, Rebekah Z. Kitto, Frances H. Arnold
- 单位
- Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, 1200 California Blvd. MC 210-41, Pasadena, CA 91125 (USA)
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2013）
- DOI
- 10.1002/anie.201301362
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
萜烯合酶催化萜类化合物合成中的关键环化步骤，但其复杂的碳正离子环化机理使得理性设计几乎不可能，而传统GC-MS分析通量低，且缺乏针对环化活性的高通量筛选方法，严重限制了萜烯合酶的定向进化改造。
研究策略
设计含有乙烯基甲基醚的合成底物3，该底物在萜烯合酶催化环化时释放甲醇，通过醇氧化酶（AOX）和Purpald的偶联反应产生比色信号，建立高通量筛选方法；将该方法用于BcBOT2的定向进化以提高热稳定性，并优化SSCG_02150的表达和反应条件。
研究路线图
核心内容
该研究针对萜烯合酶因环化机理复杂而难以理性设计、且缺乏高通量筛选方法的问题，开发了一种基于比色信号的环化活性筛选策略。作者设计含乙烯基甲基醚的合成底物3，其在酶催化环化时释放甲醇，经醇氧化酶与Purpald偶联产生可定量颜色信号，从而适用于粗裂解液的高通量筛选。利用该体系对来源于灰葡萄孢的BcBOT2进行两轮定向进化：第一轮从约2800个突变体中选出19B7（缺失3个C端氨基酸并含K85R），将T50从42°C提升至47°C；第二轮筛选约1800个突变体获得9D6（H383R），T50进一步提高至约54°C，总提升约12°C且产物特异性保持。同时证明甲醇释放与环化产物生成高度相关，并成功优化了SSCG_02150的表达条件，显示TB培养基、25°C及甜菜碱添加剂效果最佳。该工作首次实现了无需结构信息的萜烯合酶环化活性定向进化，为克服产物抑制、提升活性及耐受性等工程难题提供了通用工具。
创新点
首次开发了基于合成底物释放甲醇的萜烯合酶环化活性比色高通量筛选方法，适用于粗裂解液；无需结构信息即可对萜烯合酶进行定向进化；成功将BcBOT2热稳定性提高约12°C且保持产物特异性；该筛选系统还能快速优化表达和缓冲条件。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 倍半萜生物合成 | BcBOT2 | preslippierfolan-8β-ol synthase (from Botrytis cinerea) | 催化 | 催化FPP环化生成PSP，是研究的主要靶酶 |
| Escherichia coli | 倍半萜生物合成 | SSCG_02150 | (-)-δ-cadinene synthase (from Streptomyces clavuligerus) | 催化 | 催化生成(-)-δ-cadinene，用于表达条件优化 |
| Escherichia coli | 倍半萜生物合成 | BcBOT2 variant 19B7 | BcBOT2突变体（缺失3个C端氨基酸+K85R） | 催化 | 第一轮定向进化获得，T50为47°C，活性与产物特异性保持 |
| Escherichia coli | 倍半萜生物合成 | BcBOT2 variant 9D6 | BcBOT2突变体（H383R） | 催化 | 第二轮定向进化获得，T50约54°C，活性与产物特异性保持 |
| — | 甲醇检测 | AOX | alcohol oxidase | 催化 | 检测偶联酶，将甲醇氧化为甲醛，用于高通量筛选信号产生 |
关键发现
- 合成底物3在25 mM NH4HCO3溶液中10 mM浓度下室温稳定至少10天
- 筛选工作范围甲醇浓度约20-250 μM
- 第一轮定向进化筛选约2800个突变体获得19B7（缺失3个C端氨基酸+K85R），T50从42°C升至47°C
- 第二轮筛选约1800个突变体获得9D6（H383R），T50升至约54°C，总提高约12°C，产物特异性保持
- 19B7的甲醇释放与FPP环化产物PSP生成高度相关
- 表达优化显示TB培养基优于LB，25°C优于18°C，甜菜碱（betaine）是最佳稳定添加剂，而蔗糖有轻微背景干扰。
研究结论
该高通量筛选系统利用合成底物3可有效检测萜烯合酶环化活性，并成功应用于BcBOT2的热稳定性定向进化（提高12°C）和SSCG_02150的表达条件优化，表明该策略具有广泛适用性，可用于解决萜烯合酶工程中的产物抑制、活性提升、辅因子偏好和有机溶剂耐受等问题。