One-Pot Enzymatic Synthesis of Mercrochlorin A and B
- 作者
- Robin Teufel, Leonard Kaysser, Matthew T. Villaume, Stefan Diethelm, Mary K. Carbullido, Phil S. Baran, Bradley S. Moore
- 单位
- Center for Marine Biotechnology and Biomedicine, Scripps Institution of Oceanography, University of California San Diego, La Jolla, CA 92037, USA; Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California San Diego, La Jolla, CA 92093, USA; Department of Chemistry, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA 92037, USA
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2014）
- DOI
- 10.1002/anie.201405694
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析并体外重构海洋细菌Streptomyces sp. CNH-189中merochlorin A和B的完整生物合成途径，揭示聚酮-萜烯杂合中间体形成的酶学机制以及氧化氯化/环化反应的催化剂。
研究策略
通过异源表达和纯化四个关键酶（Mcl17, Mcl22, Mcl23, Mcl24），结合化学合成底物和产物，在体外逐级重构完整生物合成途径；同时利用基因敲除突变株和回喂实验验证各酶及中间体的体内功能。
研究路线图
核心内容
该研究解析并体外重构了海洋细菌Streptomyces sp. CNH-189中merochlorin A和B的完整生物合成途径。通过异源表达纯化四个关键酶Mcl17、Mcl22、Mcl23和Mcl24，结合化学合成底物与基因敲除回喂实验，逐级验证了各酶功能。研究发现Mcl17催化丙二酰CoA生成THN，Mcl22在镁离子存在下催化GPP与DMAPP发生非常规头-干偶联生成分支结构的isosesquia lavandulyl diphosphate，比活力达850 mU/mg；Mcl23作为首个利用分支萜烯的芳香族异戊二烯转移酶，将THN与底物缩合为pre-merochlorin，对flaviolin相对活性低于1%；Mcl24则通过氧化氯化脱芳构化和萜烯环化序列生成两种异构体产物。最终仅需四种酶及DMAPP、GPP和malonyl CoA即可一锅合成merochlorin A和B，证明极简催化组合即可实现复杂聚酮-萜烯杂合天然产物的高效合成，为meroterpenoid类化合物的酶促制备与组合生物合成提供了新策略。
创新点
['首次实现meroterpenoid类天然产物的全酶促合成，仅需四个酶即可从常见代谢物DMAPP、GPP和malonyl CoA生成结构复杂的merochlorin A和B。', "发现Mcl22催化非常规的C(1')-C(2)头-干异戊二烯偶联反应，生成具有分支结构的isosesquia lavandulyl diphosphate。", '揭示Mcl23是首个利用分支萜烯作为异戊二烯供体的芳香族异戊二烯转移酶，并表现出严格的底物特异性。', '证明单一钒依赖性卤过氧化物酶Mcl24能完成氧化氯化脱芳构化和萜烯环化序列，同时生成两种异构体产物。']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces sp. CNH-189 | merochlorin生物合成途径（聚酮合成） | mcl17 | Mcl17 | 催化 | III型聚酮合酶，催化5分子丙二酰CoA的迭代缩合与环化，生成1,3,6,8-四羟基萘（THN, 3） |
| Streptomyces sp. CNH-189 | merochlorin生物合成途径（异戊二烯偶联） | mcl22 | Mcl22 | 催化 | 分支型异戊二烯二磷酸合酶，催化GPP与DMAPP的C(1')-C(2)头-干偶联，生成isosesquia lavandulyl diphosphate（5） |
| Streptomyces sp. CNH-189 | merochlorin生物合成途径（异戊二烯转移） | mcl23 | Mcl23 | 催化 | 芳香族ABBA异戊二烯转移酶，催化3与5的缩合生成pre-merochlorin（4），是首个利用分支萜烯为异戊二烯供体的酶 |
| Streptomyces sp. CNH-189 | merochlorin生物合成途径（氯化环化） | mcl24 | Mcl24 | 催化 | 钒依赖性卤过氧化物酶，催化4的氧化氯化脱芳构化及萜烯环化，同时生成merochlorin A和B |
关键发现
- Mcl17催化丙二酰CoA生成THN (3)的比活力为2.4±0.3 mU/mg（kcat
- 47/min per malonyl-CoA）；Mcl22在5 mM MgCl2存在下催化GPP和DMAPP生成isosesquia lavandulyl diphosphate (5)的比活力为850±20 mU/mg（kcat
- 3/min），无Mg2+时活性降低约四倍；Mcl23催化3和5缩合为pre-merochlorin (4)的比活力为53±3 mU/mg（kcat
- 8/min），严格依赖Mg2+，对flaviolin的相对活性<1%；Mcl24将4转化为merochlorin A和B的比活力为17±1 mU/mg（kcat 10/min）。Mcl22还能将DMAPP与DMAPP、FPP、GGPP分别转化为C10、C20、C25分支二磷酸。完整体外途径仅需Mcl17、Mcl22、Mcl23、Mcl24四种酶及DMAPP、GPP和malonyl CoA即可合成merochlorin A和B。
研究结论
本研究完全解析了merochlorin A和B的生物合成途径，证明从简单代谢物出发仅需四个酶即可完成聚酮-萜烯杂合、选择性氯化及环化等复杂反应，是自然界利用极简催化组合生成高化学多样性的典型范例，也为meroterpenoid类天然产物的酶促合成和组合生物合成提供了新策略。