Expanding the Landscape of Diterpene Structural Diversity through Stereochemically Controlled Combinatorial Biosynthesis
- 作者
- Johan Andersen-Ranberg, Kenneth Thermann Kongstad, Morten Thrane Nielsen, Niels Bjerg Jensen, Irini Pateraki, Søren Spanner Bach, Britta Hamberger, Philipp Zerbe, Dan Staerk, Jörg Bohlmann, Birger Lindberg Møller, Björn Hamberger
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2016）
- DOI
- 10.1002/anie.201510650
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
植物来源二萜类化合物结构复杂、天然丰度低，难以工业化利用，而化学合成路线效率低且难以控制立体化学，亟需开发能够立体选择性合成结构多样二萜类化合物的生物合成方法。
研究策略
模拟植物二萜生物合成的模块化特性，将11个II类和9个I类二萜合酶（diTPS）进行系统组合，在异源宿主（烟草、酿酒酵母、大肠杆菌）中共同表达，构建51个功能性组合，并利用组合酶学实现立体选择性二萜骨架的合成。
研究路线图
核心内容
本研究模拟植物二萜生物合成的模块化特征，将11个II类和9个I类二萜合酶进行系统组合，在烟草、酿酒酵母和大肠杆菌等异源宿主中共表达，构建了51个功能性组合，其中41个为自然界不存在的新组合。通过组合酶学实现了超过50种半日花烷型和克罗烷型二萜骨架的立体选择性合成，包括天然变体及新的对映体/非对映体。关键结果方面，SsLPPS与MvTPS5组合产生的(13R)-(+)-manoyl oxide产量较天然组合提高3.7倍；CfTPS1与SsSCS组合在工程化酿酒酵母中生产(+)-manool的产量达310 mg/L，较此前报道提高3倍；稳定整合的多个组合在酵母中生产目标二萜的产量为250至370 mg/L。此外，首次实现了ent-sclareol的生物合成，并将EpTPS7和TwTPS7鉴定为ent-CPP合酶，还发现TwTPS14与SsSCS组合产生与细菌中一致的新骨架。上述工作表明，通过工程化二萜合酶的模块化组合能以立体化学可控方式扩展二萜骨架的生物合成空间，克服化学合成中的立体化学控制难题，为工业化生产高价值二萜类药物前体和香料提供了可行途径。
创新点
['构建了51个功能性diTPS组合，其中41个为自然界不存在的新组合', '实现了超过50种半日花烷型和克罗烷型二萜骨架的立体选择性生物合成，包括天然变体和新的对映体/非对映体', '在工程化酿酒酵母中实现了四种工业相关目标分子的可规模化发酵生产', '首次鉴定出多个新的ent-CPP合酶（如EpTPS7、TwTPS7）和ent-sclareol等新骨架的生物合成途径', '通过组合筛选发现TwTPS14与SsSCS组合产生与细菌中报道一致的新二萜骨架']
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana; Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | CfTPS1 | CfTPS1 | 催化 | 类I二萜合酶，与SsSCS组合高效生成(+)-manool |
| Nicotiana benthamiana; Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | CfTPS2 | CfTPS2 | 催化 | 类II二萜合酶，与CfTPS3组合生成(13R)-(+)-manoyl oxide |
| Nicotiana benthamiana; Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | CfTPS3 | CfTPS3 | 催化 | 类I二萜合酶，可转化(+)-8-LPP或与TwTPS21生成ent-manoyl氧化物 |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | SsLPPS | SsLPPS | 催化 | 类II二萜合酶，催化GGPP生成(+)-labda-13-en-8-ol diphosphate |
| Nicotiana benthamiana; Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | SsSCS | SsSCS | 催化 | 类I二萜合酶，催化多种CPP异构体生成对应的manool或sclareol |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | MvTPS5 | MvTPS5 | 催化 | 类II二萜合酶，与SsLPPS组合高效生成(13R)-(+)-manoyl oxide |
| Nicotiana benthamiana; Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | TwTPS21 | TwTPS21 | 催化 | 类II二萜合酶，提供ent-8-LPP，用于合成ent-manoyl氧化物和ent-sclareol |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | TwTPS2 | TwTPS2 | 催化 | 类I二萜合酶，与CfTPS14或EpTPS1组合生成(13S)-ent-manoyl oxide |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | TwTPS14 | TwTPS14 | 催化 | 类II二萜合酶，与SsSCS组合产生新骨架（与细菌中报道的功能一致） |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | TwTPS7 | TwTPS7 | 催化 | 类II二萜合酶，经组合筛选鉴定为ent-CPP合酶 |
| Nicotiana benthamiana; Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | EpTPS1 | EpTPS1 | 催化 | 类I二萜合酶，与TwTPS2或TwTPS21组合生成不同立体构型的manoyl氧化物 |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | EpTPS7 | EpTPS7 | 催化 | 类II二萜合酶，经组合筛选鉴定为ent-CPP合酶 |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | EpTPS8 | EpTPS8 | 催化 | 类I二萜合酶，与ent-CPP合酶组合生成ent-neoabietadiene |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | EpTPS23 | EpTPS23 | 催化 | 类I二萜合酶，与ent-CPP合酶组合生成ent-dehydroabietadiene |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | CfTPS14 | CfTPS14 | 催化 | 类II二萜合酶，不能转化(+)-8-LPP，但与TwTPS2组合生成(13S)-ent-manoyl oxide |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | ZmAN2 | ZmAN2 | 催化 | 玉米类II二萜合酶，提供ent-CPP底物 |
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | OsCPSsyn | OsCPSsyn | 催化 | 水稻syn-CPP合酶，提供syn-CPP底物 |
关键发现
- 构建了51个类I和类II二萜合酶功能组合，其中41个为“新-自然”组合
- 立体选择性合成了超过50种二萜骨架
- (13R)-(+)-manoyl oxide (16a)由SsLPPS与MvTPS5组合产生，产量比天然组合CfTPS2/CfTPS3高3.7倍
- CfTPS1与SsSCS组合在工程化酿酒酵母中生产(+)-manool (23a)，产量达到310 mg/L，较此前报道提高3倍
- 稳定整合的CfTPS1/CfTPS3、CfTPS2/CfTPS3和TwTPS21/EpTPS1组合在酿酒酵母中生产目标二萜的产量为250-370 mg/L
- 首次实现ent-sclareol的生物合成
- 发现TwTPS14与SsSCS组合产生新骨架，与最近在细菌Herpetosiphon aurantiacus中报道的功能一致
- 通过组合筛选将EpTPS7和TwTPS7鉴定为ent-CPP合酶。
研究结论
通过工程化二萜合酶的模块化组合，能够以立体化学可控的方式扩展二萜骨架的生物合成空间，克服化学合成中立体化学控制的挑战，为工业化生产高价值二萜类药物前体和香料提供了可行途径，展示了合成生物学补充化学合成的潜力。