An Unusual Terpene Cyclization Mechanism Involving a Carbon-Carbon Bond Rearrangement
- 作者
- Ayuko Meguro, Yudai Motoyoshi, Kazuya Teramoto, Shota Ueda, Yusuke Totsuka, Yumi Ando, Takeo Tomita, Seung-Young Kim, Tomoyuki Kimura, Masayuki Igarashi, Ryuichi Sawa, Tetsuro Shinada, Makoto Nishiyama, Tomohisa Kuzuyama
- 单位
- Biotechnology Research Center, The University of Tokyo; Department of Material Science, Graduate School of Science, Osaka City University; Institute of Microbial Chemistry, Tokyo
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2015）
- DOI
- 10.1002/anie.201411923
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明二萜环化酶CotB2催化生成具有特殊5-8-5并环结构的环辛-9-烯-7-醇的复杂环化反应机制
研究策略
结合体内[U-13C6]葡萄糖标记实验和体外使用区域选择性氘代GGDP底物的酶促反应，通过13C NMR和1H NMR分析产物中同位素标记位置，推断碳骨架重排和氢迁移过程
研究路线图
核心内容
该研究通过体内同位素标记与体外酶促反应相结合的策略，解析了二萜环化酶CotB2催化生成具有特殊5-8-5并环结构的环辛-9-烯-7-醇的复杂环化机制。研究者利用[U-13C6]葡萄糖喂养链霉菌，结合13C NMR分析产物中七个C-C偶联的存在，同时发现预期的C9-C10偶联缺失，从而首次揭示了碳骨架中C8/C9碳碳键发生重排。进一步使用区域选择性氘代底物进行酶促反应，通过1H NMR追踪氢迁移路径，证实了该过程包含1,3-和两个1,5-长程氢迁移，例如(10-D)-GGDP转化为(6-D)-产物，明确了C10→C6的迁移方向。基于这些证据，研究提出了一个涉及环丙基甲基正离子重排的新环化机制，并确定了产物的绝对构型为(2R,3R,6R,7S,11R,14R)。这一发现颠覆了以往对萜烯环化仅涉及氢迁移和简单环化的认知，展示了萜烯合酶通过碳碳键重排实现复杂骨架构建的非凡能力，为理解天然产物生物合成中立体化学控制的进化策略提供了新视角。
创新点
首次揭示了CotB2催化过程中存在碳碳键重排（C8/C9互换）和三个长程氢迁移（1,3-和1,5-氢迁移），提出了与以往假设不同的新环化机制
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces albus | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | cotB1 | CotB1 | 催化 | 异源表达，催化GGDP合成 |
| Streptomyces albus | 二萜环化 | cotB2 | CotB2 | 催化 | 催化GGDP环化生成环辛-9-烯-7-醇，涉及碳碳键重排和氢迁移 |
| Streptomyces albus | 环辛霉素生物合成 | cotB3 | CotB3 | 催化 | 细胞色素P450羟化酶 |
| Streptomyces albus | 环辛霉素生物合成 | cotB4 | CotB4 | 催化 | 细胞色素P450羟化酶 |
| Streptomyces melanosporofaciens MI614-43F2 | 环辛霉素生物合成 | cotB2 | CotB2 | 催化 | 原始产生菌中的二萜环化酶 |
关键发现
- 通过[U-13C6]葡萄糖喂养实验，观察到七个C-C偶联（C1-C2、C3-C18、C5-C6、C7-C19、C11-C20、C13-C14、C15-C16）存在，而预期的C9-C10偶联缺失，表明C8/C9碳碳键发生重排。氘代底物实验表明：(9,9-D2)-GGDP转化为(8,8-D2)-环辛-9-烯-7-醇，证实C8/C9重排
- (10-D)-GGDP转化为(6-D)-产物，证明C10→C6的1,5-氢迁移
- (8,8-D2)-GGDP转化为(9,15-D2)-产物，支持C8→C15的1,5-氢迁移。确定了环辛-9-烯-7-醇的绝对构型为(2R,3R,6R,7S,11R,14R)。提出新机制涉及1,3-氢迁移（C6→C3）、两个1,5-氢迁移及环丙基甲基正离子重排。
研究结论
CotB2催化一个极其复杂的区域选择性和立体特异性环化反应，涉及独特的碳碳键重排和多个氢迁移，展示了萜烯合酶进化出的合成精湛性和立体化学控制。对CotB2的进一步结构研究将有助于理解其催化机制。