An Unusual Chimeric Diterpene Synthase from Emericella varicolor and Its Functional Conversion into a Sesterterpene Synthase by Domain Swapping
- 作者
- Bin Qin, Yudai Matsuda, Takahiro Mori, Masahiro Okada, Zhiyang Quan, Takaaki Mitsuhashi, Toshiyuki Wakimoto, Ikuro Abe
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2016）
- DOI
- 10.1002/anie.201509263
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
发现并表征新型嵌合二萜合酶EvVS，并通过结构域交换将其功能转化为二倍半萜合酶，以产生新的萜类化合物。
研究策略
采用基因组挖掘技术从Emericella varicolor中发现假定的嵌合萜类合酶基因，利用米曲霉异源表达鉴定产物，通过体外酶活测定、结构域交换、同位素标记和NMR解析产物结构，阐明环化机理。
研究路线图
核心内容
本研究通过基因组挖掘从Emericella varicolor中发现了一个同时含有异戊烯基转移酶（PT）和萜类环化酶（TC）结构域的新型嵌合二萜合酶EvVS，并利用米曲霉异源表达鉴定其催化产生具有新骨架的三环二萜varideine（1，C20H32，m/z 272）。体外酶活测定显示，EvVS能以DMAPP和IPP为底物同时产生二萜1和二倍半萜2，其TC结构域可分别环化GGPP和GFPP生成对应产物。通过将EvVS的PT结构域与来自EvSS的PT结构域进行结构域交换，所得嵌合酶Swap1在米曲霉体内成功以二倍半萜2为主要产物（R/S=9:1），仅产生少量二萜1。13C标记实验揭示了1和2经由不同初始环化模式的环化机制。截短体EvVS-N349（仅含TC结构域）体外也能以GFPP为底物生成2。该工作首次通过结构域交换将二萜合酶转化为二倍半萜合酶，证明了这一策略能有效获取新萜类化合物，为其他嵌合萜类合酶的功能研究和定向改造提供了借鉴。
创新点
1. 发现了一个同时具有PT和TC结构域的新型嵌合二萜合酶EvVS，能产生新骨架二萜varideine (1)和体外产生二倍半萜2；2. 首次通过结构域交换将二萜合酶转变为二倍半萜合酶，实现了二倍半萜2在体内的产生；3. 阐明了EvVS催化不同底物产生不同碳骨架的环化机制。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus oryzae | 萜类生物合成 | evVS | EvVS | 催化 | 异源表达产生二萜varideine (1)；域交换体Swap1产生二倍半萜2 |
| Escherichia coli | 萜类生物合成 | evVS | MBP-EvVS | 催化 | 体外酶活实验表明以DMAPP和IPP为底物产生1和2 |
| — | 萜类生物合成 | evSS | EvSS (PT domain) | 催化 | 其PT结构域催化合成GFPP，用于域交换 |
| Aspergillus oryzae | 萜类生物合成 | swap1 | Swap1 (TC of EvVS + PT of EvSS) | 催化 | 域交换后体内产生2为主要产物，1为次要产物 |
| Escherichia coli | 萜类生物合成 | evVS (truncated) | EvVS-N349 | 催化 | 截短体仅含TC结构域，体外以GFPP为底物产生2 |
关键发现
- 通过基因组挖掘和异源表达，从Emericella varicolor中鉴定出新型嵌合萜类合酶EvVS，其催化产生新型三环二萜varideine (1, C20H32, m/z 272)。体外实验表明，EvVS以DMAPP和IPP为底物可同时产生二萜1和二倍半萜2
- 其TC结构域以GGPP和GFPP为底物分别环化生成1和2。将EvVS的PT结构域与EvSS的PT结构域交换后，获得的嵌合酶Swap1在米曲霉中成功产生二倍半萜2（主要产物）和少量二萜1。化合物2经NMR和手性GC-MS分析，其C-14绝对构型以(R)型为主（R/S=9:1）。通过13C标记实验提出了1和2的环化机制，两者具有不同的初始环化模式。截短体EvVS-N349（仅含TC结构域）体外以GFPP为底物可生成2。
研究结论
本研究发现了新型嵌合二萜合酶EvVS，其TC结构域具有宽泛的底物特异性，能够环化GGPP和GFPP产生不同碳骨架的萜类产物。通过结构域交换策略成功地将EvVS改造为优先产生二倍半萜的合酶，证明了该策略对获取新型萜类化合物的有效性，并为其他嵌合萜类合酶的功能研究提供了借鉴。