Reshaping an Enzyme Binding Pocket for Enhanced and Inverted Stereoselectivity: Use of Smallest Amino Acid Alphabets in Directed Evolution
- 作者
- Zhoutong Sun, Richard Lonsdale, Xu-Dong Kong, Jian-He Xu, Jiahai Zhou, Manfred T. Reetz
- 单位
- Max-Planck-Institut für Kohlenforschung, Kaiser-Wilhelm-Platz 1, 45470 Mülheim an der Ruhr, Germany; Fachbereich Chemie, Philipps-Universität Marburg, Hans-Meerwein-Strasse 4, 35032 Marburg, Germany; State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China; State Key Laboratory of Bio-organic and Natural Products Chemistry, Shanghai Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2015）
- DOI
- 10.1002/anie.201501809
- 所属领域
- 蛋白质工程/酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酶结合口袋的大随机化位点（10个残基）进行饱和突变时，传统密码子库需要天文数字的筛选工作量，如何在保持可行筛选规模的同时实现对对映选择性的有效重塑与反转。
研究策略
提出使用单一氨基酸作为最小氨基酸字母表，对包含10个残基的超大随机化位点进行饱和突变；以柠檬烯环氧化物水解酶（LEH）为模型，用缬氨酸和苯丙氨酸作为唯一构建模块构建突变库，并结合迭代饱和突变（ISM）、X射线晶体学和分子对接解析选择性机制。
研究路线图
核心内容
该研究提出利用单一氨基酸作为最小字母表，对柠檬烯环氧化物水解酶（LEH）中包含10个残基的超大随机化位点进行饱和突变，以突破传统密码子库筛选工作量巨大的瓶颈。通过分别以缬氨酸和苯丙氨酸为唯一构建模块构建突变库，仅筛选约3220个转化株即可覆盖95%的文库多样性，而传统方法需约2×10^11株。从缬氨酸库中获得S,S选择性达e.r. 93:7的突变体，苯丙氨酸库中L74F/L114F则反转选择性至R,R e.r. 7:93。经迭代饱和突变优化，最终突变体SZ92达到S,S e.r. 96:4，SZ338（L74F/L114F/M78V/I80V）达到R,R e.r. 2:98。X射线晶体学显示，尽管突变体与野生型骨架Cα均方根偏差仅0.424 Å，但SZ338的C端螺旋和loop区分别移位7.2 Å和4.3 Å，导致结合口袋显著缩小并闭合，从结构上解释了选择性翻转的机制。该工作证明单一氨基酸字母表策略可高效重塑酶结合口袋，大幅降低筛选负担，为超大随机化位点的定向进化提供了新思路。
创新点
首次在超大随机化位点（10个残基）采用单一氨基酸构建饱和突变库，将95%文库覆盖所需转化株从约2×10^11降至约3072；在同一突变库中同时获得增强的S,S选择性和反转的R,R选择性突变体；通过X射线结构解析揭示突变导致活性口袋重塑和选择性翻转的结构基础。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| — | 环氧化物水解（环氧水解酶催化环氧化物对映选择性水解为1,2-二醇） | LEH | 柠檬烯环氧化物水解酶（LEH）野生型 | 催化 | 催化环己烯氧化物水解，e.r. 52:48 |
| — | 环氧化物水解 | LEH | LEH突变体SZ92 | 催化 | S,S选择性e.r. 96:4，结构分辨率1.53 Å，与(S,S)-2复合物结构1.70 Å |
| — | 环氧化物水解 | LEH | LEH突变体SZ338 | 催化 | R,R选择性e.r. 2:98，突变位点L74F/L114F/M78V/I80V，结构2.05 Å，复合物2.25 Å |
| — | 环氧化物水解 | LEH | LEH突变体SZ19 | 催化 | 起始模板，突变L103V/L114V/I116V/F139V/L147V |
| — | 环氧化物水解 | LEH | LEH突变体SZ118 | 催化 | R,R选择性模板，突变L74F/L114F |
| — | 环氧化物水解 | LEH | 催化残基D101、D132 | 催化 | D101质子化环氧氧，D132参与活化水核亲试剂 |
关键发现
- 野生型LEH催化环己烯氧化物水解的e.r.仅为52:48（微弱的S,S选择性）。使用缬氨酸库筛选3220个转化株，得到S,S选择性达e.r. 93:7的突变体，R,R选择性可达e.r. 12:88
- 使用苯丙氨酸库，突变体L74F/L114F显示反转的R,R选择性e.r. 7:93。ISM优化后，SZ92和SZ95达到S,S e.r. 96:4
- SZ338（L74F/L114F/M78V/I80V）达到R,R e.r. 2:98，SZ342为e.r. 3:97。X射线结构显示SZ338和SZ92的骨架Cα均方根偏差仅0.424 Å和0.254 Å，但SZ338的C端螺旋（138-142）和loop 55-60分别移位7.2 Å和4.3 Å，结合口袋显著缩小并闭合。底物谱测试表明，定向进化获得的突变体对环戊烯氧化物（3）的转化率<5%，而对其他底物如5和7仍保持良好选择性（如SZ338对5为e.r. 3:97，对7为e.r. 1:99）。
研究结论
利用单一氨基酸字母表对大随机化位点进行饱和突变是一种高效重塑酶结合口袋、提升或反转对映选择性的方法，大幅降低筛选负担；X射线结构解析揭示了突变引起的构象变化是选择性改变的结构基础，该策略需根据底物和酶结构选择合适的氨基酸构建模块。