Structures and Biosynthesis of Corvol Ethers—Sesquiterpenes from the Actinomycete Kitasatospora setae
- 作者
- Patrick Rabe, Khomaizon A. K. Pahirulzaman, Jeroen S. Dickschat
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2015）
- DOI
- 10.1002/anie.201501119
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
揭示放线菌Kitasatospora setae中一个功能未知的倍半萜环化酶（YP_004903082）的催化产物，阐明其生物合成机制。
研究策略
克隆并异源表达该环化酶，以法尼基焦磷酸（FPP）为底物进行体外酶促反应；分离纯化产物，通过一维和二维NMR确定结构；利用13C和氘代标记前体孵育实验验证所提出的环化机制。
研究路线图
核心内容
研究人员从放线菌Kitasatospora setae中克隆了一个功能未知的倍半萜环化酶基因YP_004903082，并在大肠杆菌中异源表达。以法尼基焦磷酸（FPP）为底物进行体外酶促反应，分离纯化后通过一维和二维NMR确定了两种新倍半萜醚类产物corvol ether A和B的结构，其中B具有全新的碳骨架。酶促反应以B为主产物，A与B的比例约为1:3，从50 mg FPP孵育中最终获得6.4 mg B和2.5 mg A。利用(1-¹³C)FPP和(2-¹³C)FPP在D₂O/H₂O混合体系中的标记实验，结合NMR检测到的¹³C-²H耦合三重峰，证实了该环化过程包含1,10-环化、1,3-氢迁移、水进攻、第二次环化及Wagner-Meerwein重排的详细机制，并排除了替代途径。该研究不仅发现了两类新的天然产物，还展示了同位素标记NMR技术在解析复杂萜类环化机制中的高效性，为放线菌中隐性萜类生物合成基因的功能挖掘提供了范例。
创新点
发现并鉴定两种新的倍半萜醚类天然产物corvol ether A和B，其中B具有新的碳骨架；通过同位素标记实验明确了包含1,10-环化、1,3-氢迁移、水进攻、第二次环化及Wagner-Meerwein重排的详细环化机制，排除了替代机制。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 异源表达体系 | YP_004903082 | corvol ether synthase | 催化 | 用于重组表达和纯化倍半萜环化酶 |
| Kitasatospora setae | 倍半萜生物合成 | YP_004903082 | corvol ether synthase | 催化 | 天然产生corvol ethers，基因簇编码此环化酶 |
关键发现
- 重组corvol ether synthase以FPP为底物主要生成两种产物corvol ether A（1）和B（2），比例约1:3（2为主产物）
- 酶不利用GGPP，对GPP活性很低，主要生成芳樟醇
- 从50 mg FPP孵育中最终获得6.4 mg 2和2.5 mg 1
- HRMS显示2的[M+H]+为m/z 223.20864（计算值223.20564），分子式为C15H26O
- NMR确定两者均为三环倍半萜醚
- (1-13C)FPP标记实验证实产物C-6被标记，支持提出的折叠方式
- (2-13C)FPP在D2O/H2O（1:1）中孵育时，产物C-5出现2H-13C耦合三重峰，证明第二环化步骤涉及C-2位质子化。
研究结论
成功表征了来自K. setae的倍半萜环化酶，其催化FPP环化生成两个新的倍半萜醚（corvol ethers A和B），并通过同位素标记实验证实了所提出的生物合成机制，展示了13C NMR同位素标记技术在萜类环化酶机制研究中的有效性。