Discovery and Characterization of a New Family of Diterpene Cyclases in Bacteria and Fungi
- 作者
- Yan-long Yang, Shasha Zhang, Ke Ma, Yuxing Xu, Qiaoqiao Tao, Yihua Chen, Juan Chen, Shunxing Guo, Jinwei Ren, Wenzhao Wang, Yong Tao, Wen-Bing Yin, Hongwei Liu
- 单位
- State Key Laboratory of Mycology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; Chinese Academy of Sciences Key Laboratory of Microbial Physiological and Metabolic Engineering, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; Key Laboratory of Economic Plants and Biotechnology, Yunnan Key Laboratory for Wild Plant Resources, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, Yunnan, China; State Key Laboratory of Microbial Resources, Yunnan Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2017）
- DOI
- 10.1002/anie.201700565
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定细菌和真菌中新的二萜环化酶，特别是UbiA超家族中负责cyathane等骨架形成的环化酶，并揭示其多样性。
研究策略
通过基因组挖掘，以EriG蛋白序列为探针，利用序列聚类和系统发育分析，结合工程大肠杆菌异源表达和GC-MS/NMR分析，表征新二萜环化酶及其产物。
研究路线图
核心内容
本研究通过基因组挖掘策略，以担子菌猴头菌中鉴定的二萜环化酶EriG为探针，系统发掘了细菌和真菌中UbiA超家族的新型二萜环化酶。EriG被证实催化GGPP生成(-)-cyatha-3,12-diene，其Km为99.6 μM，最大速率4.0 nmol min⁻¹ mg⁻¹，在工程大肠杆菌中产量达3 mg/L。利用EriG序列进行同源搜索和系统发育分析，发现了一个包含989个同源序列的新二萜环化酶家族（簇11），并从中表征了7个来自不同微生物的新酶，包括产生neververrucosan-5β-ol的SapTC1、产生verrucosane-2β-ol的ChlTC2/ChlTC5、产生axinysense的CysTC2，以及产生具有前所未有的碳骨架的新二萜lydicene的StlTC。这项工作首次定义了UbiA超家族中一个广泛存在于细菌和真菌中的二萜环化酶新家族，极大拓展了已知二萜环化酶的多样性，为微生物二萜合酶在生物催化和代谢工程中的应用提供了新的酶学工具和分子基础。
创新点
首次鉴定了担子菌中cyathane二萜环化酶EriG；发现并定义了UbiA超家族中一个新型二萜环化酶家族（簇11）；表征了7个来自细菌和真菌的新二萜环化酶；发现了一个具有前所未有的碳骨架的新二萜lydicene。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) / E. coli BW25113 (engineered) | Cyathane diterpene biosynthesis | EriG | EriG | 催化 | 催化GGPP生成(-)-cyatha-3,12-diene (5)；Km=99.6 μM，Vmax=4.0 nmol min^-1 mg^-1；在E. coli中产量3 mg/L |
| E. coli BW25113 (engineered) | Cyathane diterpene biosynthesis | CyaTC | CyaTC | 催化 | 来自Cyathus africanus，催化GGPP生成5，与CyaP有90%同源性 |
| E. coli BW25113 (engineered) | Neververrucosane diterpene biosynthesis | SapTC1 | SapTC1 | 催化 | 来自Saprospira grandis，催化生成neververrucosan-5β-ol (8) |
| E. coli BW25113 (engineered) | Verrucosane diterpene biosynthesis | ChlTC2 | ChlTC2 | 催化 | 来自Chloroflexus sp.，催化生成verrucosane-2β-ol (9) |
| E. coli BW25113 (engineered) | Verrucosane diterpene biosynthesis | ChlTC5 | ChlTC5 | 催化 | 来自Chloroflexus sp.，与ChlTC2功能相同，催化生成verrucosane-2β-ol (9) |
| E. coli BW25113 (engineered) | Axinysense diterpene biosynthesis | CysTC2 | CysTC2 | 催化 | 来自Cystobacter violaceus，催化生成axinysense (10) |
| E. coli BW25113 (engineered) | Novel diterpene biosynthesis | StlTC | StlTC | 催化 | 来自Streptomyces lydicus，催化生成新二萜lydicene (11)，具有前所未有的碳骨架 |
关键发现
鉴定出EriG为猴头菌中负责cyathane骨架环化的二萜环化酶，催化GGPP生成(-)-cyatha-3,12-diene，Km=99.6 μM，最大速率4.0 nmol min^-1 mg^-1，在工程大肠杆菌中产量为3 mg/L。利用EriG序列进行基因组挖掘，发现UbiA超家族中新的二萜环化酶家族（簇11含989个同源序列），并表征了7个新的二萜环化酶：SapTC1产生neververrucosan-5β-ol，ChlTC2/ChlTC5产生verrucosane-2β-ol，CysTC2产生axinysense，StlTC产生新二萜lydicene（分子式C20H32，结构为2,2,4a,6a,9-五甲基-...）。
研究结论
本研究鉴定了膜结合二萜环化酶EriG，其催化GGPP生成(-)-cyatha-3,12-diene，是erinacines生物合成中的关键酶。通过基因组挖掘和异源表达，发现并表征了UbiA超家族中一个广泛存在于细菌和真菌中的新二萜环化酶家族。该研究为微生物二萜合酶在生物催化和代谢工程中的应用提供了新机会。