Astellifadiene: Structure Determination by NMR Spectroscopy and Crystalline Sponge Method, and Elucidation of its Biosynthesis
- 作者
- Yudai Matsuda, Takaaki Mitsuhashi, Shoukou Lee, Manabu Hoshino, Takahiro Mori, Masahiro Okada, Huiping Zhang, Fumiaki Hayashi, Makoto Fujita, Ikuro Abe
- 单位
- Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo; Graduate School of Engineering, The University of Tokyo, and JST-ACCEL; RIKEN Center for Life Science Technologies
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2016）
- DOI
- 10.1002/anie.201601448
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
天然产物中新骨架多环萜类化合物的结构测定（尤其是未功能化烃类的绝对构型）和其复杂环化机制的阐明。
研究策略
从Emericella varicelolor NBRC 32302基因组中挖掘萜烯合酶基因EvAS，在Aspergillus oryzae中异源表达获得新化合物astellifadiene；利用NMR结合晶体海绵法快速确定其平面结构、相对构型和绝对构型；通过体内和体外的同位素标记实验以及体外酶反应，推断其环化机理。
研究路线图
核心内容
该研究从Emericella varicelolor NBRC 32302基因组中挖掘到一个编码716个氨基酸的双功能萜烯合酶基因EvAS，并在米曲霉中异源表达，成功获得新倍半萜烃astellifadiene。该化合物分子式为C25H40，具有前所未有的6-8-6-5四环骨架。研究采用NMR结合晶体海绵法确定了其平面结构、相对构型和绝对构型，仅需10 μg油状样品即可完成测定，Flack参数为0.071(6)。同位素标记实验揭示其独特的环化机制：第二环化由质子化启动，经历1,2-烷基迁移和1,5-氢迁移，首次去质子化发生在来源于DMAPP的C5甲基上。该方法首次将晶体海绵法应用于未功能化烃类天然产物的绝对构型测定，为复杂萜类化合物的结构解析提供了高效方案，同时也为理解萜烯合酶催化的多样化环化机制提供了新见解。
创新点
首次将晶体海绵法应用于无功能化烃类天然产物的绝对构型测定；发现具有新颖6-8-6-5四环骨架的倍半萜烃astellifadiene；揭示了质子化启始的第二环化序列、1,2-烷基迁移和1,5-氢迁移构成的独特环化模式。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus oryzae NSAR1 | sesterterpene biosynthesis | EvAS | EvAS (bifunctional terpene synthase) | 催化 | 异源表达产生astellifadiene (1) |
| Emericella varicelolor NBRC 32302 | sesterterpene biosynthesis | EvAS | EvAS | 催化 | 基因组挖掘的来源菌株 |
| Escherichia coli | sesterterpene biosynthesis | EvAS | EvAS (recombinant) | 催化 | 体外酶活实验验证环化机制 |
关键发现
- 从Emericella varicelolor NBRC 32302中克隆并异源表达了一个编码716个氨基酸的双功能萜烯合酶EvAS，在Aspergillus oryzae中产生了新倍半萜烃astellifadiene (1)，其m/z为340 [M]+，分子式为C25H40，具有六个不饱和度。通过NMR分析确定其平面结构为前所未有的6-8-6-5四环系统，相对构型为2S*，3S*，7R*，11R*，14R*，15S*，18S*。晶体海绵法确定了绝对构型为2S，3S，7R，11R，14R，15S，18S，Flack参数为0.071(6)，Hooft参数为0.056(6)。同位素标记实验显示，当使用[1-13C]乙酸钠时，1在C1，C3，C5，C7，C9，C11，C13，C15，C17和C19十个位置被标记
- 使用[1-13C,2H3]乙酸钠时，C24被氘代，表明第一次去质子化发生在来源于DMAPP C5的甲基上
- 在2H2O中的体外试验中，观察到一个氘原子掺入1中，证实了第二环化由质子化启动。晶体海绵法分析仅需10 μg油状样品即可完成结构测定。
研究结论
通过基因组挖掘与晶体海绵法相结合，成功快速鉴定了新骨架倍半萜astellifadiene的结构，并通过同位素标记实验阐明了其独特的环化机制，证明了该方法在复杂天然产物结构解析中的高效性和普适性。