AibA/AibB Induces an Intramolecular Decarboxylation in Isovalerate Biosynthesis by Myxococcus xanthus
- 作者
- Tobias Bock, Eva Luxenburger, Judith Hoffmann, Vlad Schütz, Christian Feiler, Rolf Müller, Wulf Blankenfeldt
- 单位
- Structure and Function of Proteins, Helmholtz Centre for Infection Research; Department of Microbial Natural Products, Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland, Saarland University; Institute of Reconstructive Neurobiology, University Hospital Bonn, University of Bonn; Macromolecular Crystallography, Helmholtz-Zentrum Berlin für Materialien und Energie; Institute of Biochemistry, Biotechnology and Bioinformatics, Technische Universität Braunschweig
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2017）
- DOI
- 10.1002/anie.201701992
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明黄单胞菌（Myxococcus xanthus）中异戊酰辅酶A生物合成关键酶AibA/AibB催化无辅因子脱羧反应的分子机制，此前该酶被误注释为CoA转移酶，且活性位点半胱氨酸的作用存在争议。
研究策略
优化AibA/AibB在大肠杆菌中的重组表达，利用X射线晶体学解析其游离态及与底物类似物、过渡态模拟物的复合物结构，结合定点突变和体外活性测定，验证催化机制。
研究路线图
核心内容
该研究通过优化AibA/AibB在大肠杆菌中的重组表达，使可溶性蛋白产量达到2.5 mg/L培养，较此前几微克水平显著提升。利用X射线晶体学解析了游离态酶及与底物类似物3MG、过渡态模拟物2m1c的复合物结构，分辨率最高达1.52 Å，Rcryst为14.1%、Rfree为15.7%。结合定点突变与体外活性测定，证明Cys56突变为Ala、Ser、Asn或Val后酶仍保留脱羧活性，且突变体与野生型结构rmsd仅0.14–0.17 Å，表明该残基并非催化必需。结构分析显示，底物类似物以弯曲构象结合于疏水活性腔，其γ-羧酸处于强疏水环境，而过渡态模拟物仅(1R,2S)-cis异构体可被结合。据此提出并验证了AibA/AibB通过疏水腔束缚底物MG-CoA、促使其弯曲并诱导分子内周环脱羧生成DMA-CoA的新机制，这是首个采用此类无辅因子脱羧机制的酶。该高效表达系统为合成生物学中异丁烯的可再生生产提供了可行工具。
创新点
建立了高效表达系统，使可溶性蛋白产量提高至毫克级；解析了1.52 Å高分辨率晶体结构；通过突变证明Cys56并非催化必需；首次提出并验证了AibA/AibB通过诱导底物分子内周环脱羧的机制，这是无辅因子脱羧酶的一种新机制。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | aib（alternative isovaleryl-CoA biosynthesis） | aibA | AibA | 催化 | 与AibB形成异二聚体，构成脱羧酶催化亚基 |
| Escherichia coli | aib（alternative isovaleryl-CoA biosynthesis） | aibB | AibB | 催化 | 与AibA形成异二聚体，N端融合T7溶菌酶提高可溶性表达 |
关键发现
- 可溶性AibA/AibB产量达2.5 mg/L大肠杆菌培养（较之前几微克显著提高）
- 晶体结构解析至1.52 Å分辨率，Rcryst=14.1%，Rfree=15.7%
- 异四聚体相互作用表面积为12110 Ų
- Cys56突变为Ala/Ser/Asn/Val后均保留脱羧活性，突变体与野生型结构rmsd为0.14-0.17 Å
- 底物类似物3MG以弯曲构象结合于疏水活性腔，其γ-羧酸处于强疏水环境
- 过渡态模拟物2m1c仅(1R,2S)-cis异构体结合，结合结构分辨率为1.6 Å。
研究结论
AibA/AibB通过其疏水活性腔束缚底物MG-CoA，迫使其处于弯曲构象并促进γ-羧基质子化，从而诱导底物自身发生分子内周环脱羧，形成DMA-CoA；Cys56不参与催化。该酶是首个采用这种无辅因子分子内脱羧机制的酶，其高效表达系统可用于合成生物学中异丁烯的可再生生产。