Spata-13,17-diene Synthase—An Enzyme with Sesqui-, Di-, and Sesterterpene Synthase Activity from Streptomyces xinghaiensis
- 作者
- Jan Rinkel, Lukas Lauterbach, Jeroen S. Dickschat
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2017）
- DOI
- 10.1002/anie.201711142
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
表征海洋细菌 Streptomyces xinghaiensis 中一种多功能萜类合酶，揭示其广谱底物特异性、产物结构、催化机制，特别是金属辅因子依赖性及其分子基础。
研究策略
基因克隆与异源表达、体外酶活测定、NMR和GC/MS结构鉴定、全位点13C同位素标记实验、立体选择性氘标记、金属离子替换实验、定点突变及系统发育分析。
研究路线图
核心内容
该研究从海洋细菌 Streptomyces xinghaiensis 中鉴定并表征了一个多功能萜类合酶 SpS。通过异源表达、体外酶活测定及 NMR 和 GC/MS 结构鉴定，发现 SpS 能接受法尼基焦磷酸、香叶基香叶基焦磷酸、香叶基法尼基焦磷酸和 14,15-二氢香叶基香叶基焦磷酸等多种底物，分别产生倍半萜、二萜和酯萜产物，但不接受香叶基焦磷酸。以 GGPP 为底物时主产物 spata-13,17-diene 的分离产率达 14%。金属离子替换实验表明 Mn²⁺ 催化效率约为 Mg²⁺ 的 3 倍，定点突变则揭示第 217 位高度保守的天冬氨酸残基是关键决定因素，将其突变为谷氨酸后酶活提高至 170%，而 P83A、L90A 和 E184Q 突变均显著降低或完全丧失活性。全位点 ¹³C 同位素标记和立体选择性氘标记实验完整阐明了 1,10-环化、环丙烷中间体及 1,3-氢迁移等催化机制步骤，并修正了 prespatane 的结构。该研究首次报道了兼具三类萜类合酶活性的细菌酶，为理解萜类合酶底物多样性和金属辅因子选择机制提供了新见解。
创新点
首次报道具有倍半萜、二萜和酯萜合酶活性的细菌萜类合酶；通过同位素和立体化学实验完整阐明催化机制；发现一个高度保守的Asp残基（Asp-217）决定了Mn2+依赖性催化，突变为Glu后活性增强；对prespatane的结构提出修正。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌（Escherichia coli） | 异源表达 | WP_095757924 | Spata-13,17-diene synthase (SpS) | 催化 | 来自Streptomyces xinghaiensis S187，通过pYE-Express载体在E. coli中表达 |
| 无细胞体系（体外酶促反应） | 萜类生物合成 | 来自Streptomyces cyaneofuscatus的GGPPS基因 | 香叶基香叶基焦磷酸合酶（GGPPS） | 催化 | 用于合成GGPP及同位素标记底物 |
| 大肠杆菌（Escherichia coli） | 萜类环化 | SpS基因（WP_095757924）突变体 | SpS突变体（P83A、L90A、E184Q、D217E等） | 催化 | 定点突变用于研究关键残基的功能，D217E突变活性增强至170% |
关键发现
- SpS可接受FPP、GGPP、GFPP和14,15-二氢GGPP，但不接受GPP。以GGPP为底物时主产物spata-13,17-diene（1）分离得6 mg（产率14%），副产物2和3分别得0.6 mg（1%）和0.8 mg（2%）。以GFPP为底物得prenylspata-13,17-diene（6）0.9 mg（1%）
- 以14,15-二氢GGPP为底物得spat-13-ene（8）1.8 mg（5%）。金属离子实验表明Mn2+催化效率约为Mg2+的3倍。定点突变显示P83A完全失活，L90A活性降低至3%，E184Q活性降至0.5%，而D217E突变使表达水平和催化效率提高到170%。同位素标记实验确定了各产物形成的立体化学，并验证了1,10-环化、环丙烷中间体及1,3-氢迁移等机制步骤。
研究结论
SpS是第一种具有倍半萜、二萜和酯萜合酶活性的细菌萜类合酶，其广谱底物特异性和独特的金属辅因子依赖性由第217位Asp调控，该残基在大多数细菌TS中为Glu；D217E突变可提高酶活性。研究为理解萜类合酶催化多样性和金属辅因子选择提供新见解，并修正了prespatane的结构。