Diverged Plant Terpene Synthases Reroute the Carbocation Cyclization Path towards the Formation of Unprecedented 6/11/5 and 6/6/7/5 Sesterterpene Scaffolds
- 作者
- Ancheng C. Huang, Young J. Hong, Andrew D. Bond, Dean J. Tantillo, Anne Osbourn
- 杂志
- Angew. Chem. Int. Ed.（2017）
- DOI
- 10.1002/anie.201711444
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
植物中二倍半萜合成酶功能表征稀少，其碳正离子环化路径多样性和分子机制尚不明确，特别是产生新骨架的环化途径有待揭示。
研究策略
利用基因组挖掘和系统发育分析从十字花科植物中筛选出4个新的支系IV二倍半萜合成酶基因，在本氏烟草中与GFPP合酶共表达；通过代谢物分离、NMR和X射线衍射解析产物结构；结合D2O标记喂养实验、定点突变和量子化学计算阐明环化机理。
研究路线图
核心内容
本研究通过基因组挖掘和系统发育分析，从十字花科植物中筛选出四个新的支系IV二倍半萜合酶基因（Cst725、Cr089、ATPS17及Br580），并在本氏烟草中与GFPP合酶共表达，成功获得多种m/z=340的二倍半萜产物。通过NMR和X射线衍射解析，发现其中3a/3b具有前所未有的6/11/5稠环骨架，而4–8则呈现6/6/7/5骨架，极大拓展了植物二倍半萜的骨架多样性。结合D₂O标记喂养实验、定点突变和量子化学计算，研究提出了一条包含再质子化、分子内1,6-质子转移及协同但异步双环化的统一环化路径；关键残基Lys424被证实参与再质子化步骤，其突变体ATPS17K424A仍保留野生型约68%的活性，且产物7和8与2a的峰面积比由2.5降至1.3，表明该残基对路径分支具有调控作用。量子化学计算显示D到F的转化能垒约为18 kcal/mol，进一步支持了所提出的环化机理。该工作揭示了系统发育上分化的植物萜类合酶通过新路径生成新骨架的化学潜力，为萜类合酶的蛋白工程改造及新型天然产物发掘奠定了重要基础。
创新点
发现4个新的植物二倍半萜合酶，产生前所未有的6/11/5和6/6/7/5稠环骨架；提出了包含再质子化、分子内1,6-质子转移和协同但异步双环化的新环化路径；通过突变鉴定出关键残基Lys424参与再质子化过程。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 二倍半萜生物合成 | Cst725 | Cst725（二倍半萜合酶） | 催化 | 来自亚麻荠（Camelina sativa），催化GFPP环化生成新骨架产物 |
| Nicotiana benthamiana | 二倍半萜生物合成 | Cr089 | Cr089（二倍半萜合酶） | 催化 | 来自 Capsella rubella，催化GFPP环化 |
| Nicotiana benthamiana | 二倍半萜生物合成 | ATPS17 | ATPS17（二倍半萜合酶） | 催化 | 来自拟南芥（Arabidopsis thaliana），突变体K424I影响再质子化及四环产物生成 |
| Nicotiana benthamiana | 二倍半萜生物合成 | Br580 | Br580（二倍半萜合酶） | 催化 | 来自芜菁（Brassica rapa），与Cst725序列一致性74%，产物谱相似 |
| Nicotiana benthamiana | 二倍半萜生物合成 | AtGFPPS1 | GFPP合酶（geranylfarnesyl diphosphate synthase） | 催化 | 负责合成底物geranylfarnesyl diphosphate (GFPP) |
关键发现
- 新合酶催化产生m/z=340的二倍半萜产物2-8，其中3a/3b具有6/11/5骨架，4-8具有6/6/7/5骨架
- 突变体ATPS17K4241保留约68%野生型活性，其7和8与2a的峰面积比为1.3，野生型为2.5
- D2O喂养实验中341/340碎片比例随时间增加
- 量子化学计算表明D→F转化能垒约18 kcal/mol
- Cst725与Br580氨基酸序列一致性为74%。
研究结论
系统发育上分化的植物二倍半萜合酶通过新的统一环化途径生成前所未有的6/11/5和6/6/7/5骨架，其中Lys424参与再质子化步骤。该工作揭示了植物萜类合酶多样化的化学潜力，为蛋白工程和天然产物发现奠定了基础。