Chemoenzymatic Late-Stage Modifications Enable Downstream Click-Mediated Fluorescent Tagging of Peptides
- 作者
- Alessandro Colombano, Luca Dalponte, Sergio Dall'Angelo, Claudia Clemente, Mohannad Idress, Ahmad Ghazal, Wael E. Houssen
- 单位
- Institute of Medical Sciences, University of Aberdeen; Department of Chemistry, University of Aberdeen; Abzena, Babraham Research Campus
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2023）
- DOI
- 10.1002/anie.202215979
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
实现环肽等肽类化合物的后期功能化修饰，以便引入可点击基团并进行荧光标记，解决环肽后期修饰困难的问题。
研究策略
利用蓝藻细菌素生物合成途径中的N1-色氨酸异戊烯基转移酶AcyF，合成并筛选含有反应性基团的非天然烷基焦磷酸类似物库，将反应性烷基链转移至含色氨酸的环肽底物上，随后通过反电子需求Diels-Alder（IEDDA）点击反应将荧光四嗪探针连接到酶修饰后的环肽上。
核心内容
本研究通过化学酶法结合点击化学策略，实现了环肽类化合物的后期功能化修饰与荧光标记。作者利用蓝藻细菌素生物合成途径中的N1-色氨酸异戊烯基转移酶AcyF，合成并筛选了含有反应性基团的非天然烷基焦磷酸类似物库（1–23），用于将反应性烷基链转移至含色氨酸的环肽底物上。结果显示AcyF可接受六种非天然供体，其中供体20在500 μM环肽、24小时、30°C条件下转化率达72%±1.3，其动力学参数（Km=0.44±0.03 mM，kcat=0.013±0.001 s⁻¹）与天然供体接近，表明该酶具有宽泛的底物耐受性。值得注意的是，供体20被酶催化后发生重排生成结构27而非预期产物26，经HRMS确认分子式为C₅₆H₈₀N₁₂O₁₄。随后通过反电子需求Diels-Alder（IEDDA）点击反应将荧光四嗪探针连接至酶修饰后的环肽上，检测到二氢哒嗪型产物（转化率约16%，441 nm处有吸收），而未修饰环肽无对照产物。该工作首次验证了化学酶法结合点击化学用于复杂环肽后期荧光标记的可行性，为环肽类化合物的功能化研究提供了新途径。
创新点
首次展示化学酶法结合点击化学对复杂环肽进行后期荧光标记；鉴定AcyF对非天然异戊烯供体的宽泛耐受性；发现非天然供体20被酶催化后发生重排生成结构27而非预期产物26。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| — | anacyclamide A8P pathway | acyF | AcyF | 催化 | N1-色氨酸异戊烯基转移酶，催化异戊烯/香叶基从焦磷酸供体转移至环肽色氨酸的吲哚N1位 |
关键发现
- 合成的烷基焦磷酸类似物库（1-23）中，AcyF接受1、3、6、8、20和22；在500 μM环肽、24 h、30°C条件下，供体20的底物转化率为72%±1.3（n=3）；供体20的Km为0.44±0.03 mM，kcat为0.013±0.001 s⁻¹，kcat/Km为29.4±3.9 s⁻¹ M⁻¹；天然供体1的Km为0.25±0.01 mM，kcat为0.013±0.0008 s⁻¹，kcat/Km为51.4±5.2 s⁻¹ M⁻¹；产物27的HRMS显示[M+H]⁺为m/z
- 5999（对应分子式C₅₆H₈₀N₁₂O₁₄）；点击反应后观察到m/z
- 3956（C₉₃H₁₀₆N₁₈O₂₁）和m/z
- 3881（C₉₃H₁₀₄N₁₈O₂₁），二氢哒嗪型产物转化率约16%，产物在441 nm处有吸收；未修饰环肽24与四嗪28无点击产物。
研究结论
本研究合成了带有反应性基团的非天然烷基焦磷酸供体库，证明AcyF对异戊烯供体具有宽泛耐受性，可将反应性基团后期引入环肽，并通过IEDDA点击反应成功实现荧光标记，首次验证了该化学酶法路线用于复杂环肽后期功能化的可行性。