Cytochrome P450 Mediated Cyclization in Eunicellane Derived Diterpenoid Biosynthesis
- 作者
- Zengyuan Wang, Qian Yang, Jingyi He, Haixin Li, Xingming Pan, Zining Li, Hui-Min Xu, Jeffrey D. Rudolf, Dean J. Tantillo, Liao-Bin Dong
- 单位
- State Key Laboratory of Natural Medicines, School of Traditional Chinese Pharmacy, China Pharmaceutical University; Department of Chemistry, University of California-Davis; Department of Chemistry, University of Florida; The Public Laboratory Platform, China Pharmaceutical University
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2023）
- DOI
- 10.1002/anie.202312490
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
揭示细胞色素P450酶在eunicellane衍生的二萜生物合成中介导环化反应的新机制，特别是P450作为类萜烯环化酶参与初始骨架构建的罕见现象。
研究策略
通过基因组挖掘发现隐性的ari生物合成基因簇，利用异源表达激活基因簇，结合体内基因敲除、体外生化实验和量子化学计算，系统阐明TC（AriE）与P450（AriF）协同构建6/7/5三环二萜骨架的途径。
研究路线图
核心内容
该研究通过基因组挖掘从嗜热放线菌Amycolatopsis arida中发现了一个隐性的ari生物合成基因簇，并借助异源表达成功激活，分离鉴定了三种高度氧化的6/7/5三环二萜aridacins A-C。研究揭示了一种前所未有的萜类骨架构建策略：萜烯环化酶AriE先将GGPP环化为6/10双环cis-eunicellane骨架，随后细胞色素P450酶AriF通过催化C2-C6键形成，将该骨架进一步环化为6/7/5三环结构。这是首次发现P450在二萜生物合成中作为环化酶参与初始骨架构建而非末端修饰。基因敲除实验证实，敲除AriF后积累双环中间体，而敲除AriD则使产量降至10%以下。量子化学计算表明氢提取能垒为23 kcal/mol，环化能垒约15 kcal/mol，支持P450通过氢提取后电子转移耦合无垒碳正离子环化的机制。该工作扩展了P450催化功能的多样性，为萜类碳正离子骨架构建原理提供了新认知。
创新点
首次发现P450（AriF）在二萜生物合成中与萜烯环化酶（AriE）串联工作，参与初始骨架构建而非末端修饰；提出并验证了氢提取后电子转移耦合无垒碳正离子环化的全新机制；扩展了P450催化能力的多样性。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Amycolatopsis arida CGMCC 4.5579 | eunicellane二萜生物合成 | ari BGC | — | 调控 | 天然宿主中的隐型基因簇，实验室条件下不表达 |
| Streptomyces lividans DL10011 | eunicellane二萜生物合成 | ariA-ariG | — | 调控 | 异源表达整个ari BGC，产生aridacins A-C及shunt产物8-11 |
| E. coli DL10026 | 二萜生物合成 | ariE | AriE | 催化 | 类I萜烯环化酶，催化GGPP环化生成6/10双环cis-eunicellane骨架4 |
| E. coli DL10028 / S. albus J1074 | 二萜生物合成 | ariF | AriF | 催化 | 细胞色素P450，催化4经C2-C6键环化形成6/7/5三环骨架5；同时介导羟基化和环氧化反应 |
| Streptomyces lividans DL10020 | eunicellane二萜生物合成 | ariF | AriF | 催化 | 基因敲除株积累化合物4，证明AriF负责三环形成 |
| Streptomyces lividans DL10021 | eunicellane二萜生物合成 | ariG | AriG | 催化 | 缺失ariG导致只积累1和2，表明AriG负责C-12羟基化 |
| Streptomyces lividans DL10018 | eunicellane二萜生物合成 | ariD | AriD | 催化 | P450酶，缺失后产生4，未确定具体催化步骤，可能参与后续氧化 |
关键发现
- 从嗜热放线菌Amycolatopsis arida中基因组挖掘出ari基因簇，通过异源表达分离鉴定了三种高度氧化的6/7/5三环二萜aridacins A-C（1-3）；AriE将GGPP环化为6/10双环cis-eunicellane骨架（化合物4），AriF通过C2-C6键形成催化环化生成6/7/5三环骨架（化合物5）；量子化学计算表明氢提取能垒为23 kcal/mol，环化能垒约15 kcal/mol，电子转移与环化耦合并无垒；敲除AriF后积累化合物4，敲除AriD产量显著降低（<10%）；HRESIMS数据m/z
- 2063（1），GC-MS显示5的分子离子峰m/z
- 17；AriE与Bnd4序列一致性71.6%。
研究结论
本研究揭示了二萜骨架构建的新策略：TC（AriE）和P450（AriF）协同作用，先由TC产生6/10双环骨架，再由P450催化形成6/7/5三环骨架，代表了萜类骨架构建中前所未有的策略；量子化学计算支持P450通过电子转移耦合环化生成碳正离子的机制。该发现扩展了P450的催化能力和多样性，为理解萜类生物合成中碳正离子的产生原理奠定了基础。