Controlling Monoterpene Isomerization by Guiding Challenging Carbocation Rearrangement Reactions in Engineered Squalene-Hopene Cyclases
- 作者
- Julian Ludwig, Christian Curado-Carballada, Stephan C. Hammer, Andreas Schneider, Svenja Diether, Nico Kress, Sergi Ruiz-Barragán, Silvia Osuna, Bernhard Hauer
- 单位
- Institute of Biochemistry and Technical Biochemistry, University of Stuttgart; Institut de Quimica Computacional i Catalisi (IQCC) and Departament de Quimica, Universitat de Girona; Faculty of Chemistry, Organic Chemistry and Biocatalysis, Bielefeld University; Departament de Fisica, Universitat Politecnica de Catalunya; ICREA
- 杂志
- Angewandte Chemie International Edition（2024）
- DOI
- 10.1002/anie.202318913
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
传统酸催化剂难以选择性控制单萜异构化过程中复杂的碳正离子重排网络，而天然单萜环化酶依赖磷酸化底物；本研究旨在改造鲨烯-藿烯环化酶（AacSHC），使其无需离去基团即可高选择性催化单萜异构化，尤其实现(+)-β-蒎烯向(+)-龙脑的精准转化。
研究策略
以AacSHC为模板，先对活性位点疏水/芳香族残基进行半理性单点突变筛选，再通过迭代饱和突变（22c-trick）进行定向进化，结合AlphaFold2建模、CAVER隧道分析、分子动力学（MD）模拟和QM-metadynamics计算，解析突变对活性口袋重塑和水网络调控的作用机制。
研究路线图
核心内容
本研究以鲨烯-藿烯环化酶（AacSHC）为模板，通过半理性单点突变筛选与10轮迭代饱和突变定向进化，成功将该类II三萜环化酶改造为高选择性单萜异构化催化剂，实现无需磷酸化底物或离去基团的(+)‑β‑蒎烯向(+)-龙脑的精准转化。关键突变Y609W使α-蒎烯选择性达88%并提高活性2.8倍；八重变体V10（A306W/W312G/G315I/F365W/Y420F/V448I/Y609M/Y612F）将(+)-龙脑选择性从野生型的1.2%提升至90.2%，产物形成增加186倍，非对映选择性达99.6% de。制备级转化中，200 g/L静息大肠杆菌细胞转化10 mM底物，14天完全转化，纯化获得1.3 g(+)-龙脑，产率84.3%。AlphaFold2建模、分子动力学模拟及QM-metadynamics计算揭示，F365W与W312G的组合通过重塑活性位点芳香族残基并引导水分子靠近异冰片基碳正离子，将其相对稳定性降低约20 kcal/mol，从而精确控制碳正离子重排终止途径。V10对多种单萜底物均表现出向龙脑选择性增加27–180倍的倾向。该工作首次在类II三萜环化酶中实现对单萜碳正离子重排的高选择性引导，其选择性超越所有已报道的人工和天然催化剂，为利用丰富萜烯资源定向重构碳骨架提供了通用策略。
创新点
首次在类II三萜环化酶中实现对单萜碳正离子重排的高选择性引导；通过重塑芳香族残基和水分子网络，使次级异冰片基碳正离子得以稳定并选择性终止；无需磷酸化底物或离去基团，即可达到甚至超越天然单萜环化酶的选择性；展示了可调控的阳离子导向策略。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 单萜异构化（β-蒎烯→龙脑） | AacSHC（野生型） | 鲨烯-藿烯环化酶（SHC） | 催化 | 来源于Alicyclobacillus acidocaldarius，DxDD motif中的天冬氨酸催化质子化起始反应 |
| Escherichia coli | 单萜异构化（β-蒎烯→龙脑） | V10变体（A306W/W312G/G315I/F365W/Y420F/V448I/Y609M/Y612F） | 鲨烯-藿烯环化酶突变体 | 催化 | 通过迭代饱和突变获得，将(+)-龙脑选择性提高至90.2%，de 99.6% |
| Escherichia coli | 单萜异构化（底物谱扩展） | W312A/W312G单突变体 | 鲨烯-藿烯环化酶突变体 | 调控 | W312是底物结合关键位点，小残基突变破坏原有结合，改变产物分布并提高龙脑形成 |
| Escherichia coli | 单萜异构化（(+)-龙脑合成） | W312G/F365W双突变体 | 鲨烯-藿烯环化酶突变体 | 催化 | 双变体选择性达43.2%，F365W新吲哚环定位有利于水分子锚定和碳正离子稳定 |
| Escherichia coli | 单萜异构化（对比天然酶） | BPPS（(+)-龙脑基二磷酸合酶） | (+)-龙脑基二磷酸合酶 | 催化 | 天然酶需要二磷酸基团作为离去基团，其选择性为75%，V10变体选择性超越该天然酶 |
关键发现
- 野生型AacSHC转化(+)-β-蒎烯2a时产物复杂
- 单点突变L36A、W312A、Y609W分别使主产物选择性达53%（柠檬烯）、50%（α-松油醇）和88%（α-蒎烯），其中Y609W使活性提高2.8倍
- 变体W312A使龙脑选择性达10.5%，较野生型提高8.7倍。通过10轮迭代饱和突变获得八重变体V10（A306W/W312G/G315I/F365W/Y420F/V448I/Y609M/Y612F），将(+)-龙脑选择性从1.2%提高至90.2%，产物形成增加186倍，非对映选择性>99% de（99.6% de）
- 动力学参数显示Km从2.29 mM降至1.43 mM，kcat从1.37 h⁻¹升至2.12 h⁻¹。制备级转化中，用200 g/L静息E. coli细胞转化10 mM 2a，14天后底物完全转化，纯化获得1.3 g(+)-龙脑，产率84.3%，de 99.6%。V10对多种单萜底物（如蒎烯异构体、桧烯）均表现出向龙脑选择性增加27–180倍的趋势。计算模拟表明，水分子靠近异冰片基碳正离子可将其相对稳定性降低约20 kcal/mol，V10中F365W与W312G的组合促进水聚类在催化天冬氨酸附近定向排列。
研究结论
研究表明，通过改造AacSHC的活性位点芳香族残基和水网络，可以精确控制碳正离子重排途径，实现无离去基团依赖的难控单萜异构化。工程化V10变体能在克级规模上高选择性合成(+)-龙脑，其选择性超过所有已报道的人工和天然催化剂，为利用丰富萜烯资源定向重构碳骨架提供了通用策略。