A phthalate family oxygenase reductase supports terpene alcohol oxidation by CYP238A1 from Pseudomonas putida KT2440
- 作者
- Stephen Graham Bell, Laura French, Nicholas Huw Rees, Sophia Shuyi Cheng, Gail Preston, Luet-Lok Wong
- 单位
- School of Chemistry and Physics, The University of Adelaide; Department of Chemistry, University of Oxford, Inorganic Chemistry Laboratory; Department of Plant Sciences, University of Oxford
- 杂志
- Biotechnology and Applied Biochemistry（2013）
- DOI
- 10.1002/bab.1084
- 所属领域
- 代谢工程 / 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定恶臭假单胞菌KT2440中CYP238A1（PP1955）的底物特异性及其天然电子传递伙伴，并解析该P450酶参与萜烯醇氧化的分子机制。
研究策略
将CYP238A1和另一个P450（PP1950）以及邻苯二甲酸家族氧还原酶（PP1957）在E. coli中异源表达、纯化，通过I型光谱位移筛选底物，利用PFOR重建体外单加氧酶活性，并构建E. coli全细胞氧化体系进行产物分离和结构鉴定。
研究路线图
核心内容
该研究鉴定并表征了恶臭假单胞菌KT2440中细胞色素P450酶CYP238A1（PP1955）的底物特异性和电子传递伙伴。作者在E. coli中异源表达纯化了CYP238A1及邻苯二甲酸家族氧还原酶（PFOR, PP1957），通过光谱筛选发现CYP238A1可结合多种单萜和倍半萜醇，其中cis-nerolidol诱导55%高自旋血红素，结合常数Kd为1.96 μM。体外重建实验表明PFOR能有效支持CYP238A1催化活性，在4 μM PFOR条件下cis-nerolidol的NADH氧化速率达170 nmol(nmol-P450)⁻¹min⁻¹，且CYP238A1以NADH或NADPH为电子供体将cis-和trans-nerolidol分别区域选择性羟基化为9-羟基产物，不攻击烯烃双键，耦联效率约20%。全细胞体系同样获得相同产物。该研究首次发现PFOR可作为非融合型电子传递蛋白支持CYP238A1催化萜烯醇氧化，揭示了P450电子传递链的新型组织形式，为萜烯醇生物转化提供了新酶元件。
创新点
首次发现邻苯二甲酸家族氧还原酶（PFOR, PP1957）可作为非融合型电子传递蛋白支持CYP238A1催化萜烯醇氧化；鉴定CYP238A1对cis/trans-nerolidol的区域选择性羟基化生成9-羟基神经醇；提出CYP238A1/PP1957可能代表一类新型的P450电子传递链组织形式。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida KT2440 | 萜烯醇氧化代谢 | PP1955 | CYP238A1 | 催化 | 细胞色素P450酶，氧化cis/trans-nerolidol生成9-羟基产物，也能氧化farnesol |
| Pseudomonas putida KT2440 | P450电子传递链 | PP1957 | PFOR (邻苯二甲酸家族氧还原酶) | 能量供给 | 从NADH/NADPH接受电子并传递给CYP238A1，支持其单加氧酶活性 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 未知代谢途径 | PP1950 | PP1950 | 催化 | 另一个P450酶，经筛选未发现底物，与3-氯苯甲酸诱导相关 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜烯醇氧化代谢 | PP1955 | CYP238A1 | 催化 | 异源表达用于体外和全细胞氧化实验 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | P450电子传递链 | PP1957 | PFOR (邻苯二甲酸家族氧还原酶) | 能量供给 | 与CYP238A1共表达于pETDuet载体，构建全细胞氧化体系 |
关键发现
- CYP238A1可结合多种单萜和倍半萜醇，其中cis-nerolidol诱导55%高自旋血红素，结合常数Kd为1.96 ±
- 08 μM；farnesol诱导25%高自旋，Kd为9.0 ±
- 6 μM。在体外重建体系中，0.5 μM CYP238A1和1 μM PFOR条件下，cis-nerolidol的NADH氧化速率为45 ± 2 nmol(nmol-P450)-1 min-1，NADPH速率为37 ± 3 nmol(nmol-P450)-1 min-1；当PFOR浓度增至4 μM时，NADH和NADPH速率分别提高到170和160 nmol(nmol-P450)-1 min-1。farnesol的NADH消耗速率为58 ±
- 1 nmol(nmol-P450)-1 min-1。CYP238A1以NADH或NADPH为电子供体将cis-nerolidol和trans-nerolidol分别单一氧化为9-羟基-cis-nerolidol和9-羟基-trans-nerolidol，未攻击烯烃双键，耦联效率约20%。全细胞体系可产生相同产物。
研究结论
CYP238A1（PP1955）是恶臭假单胞菌KT2440中的萜烯醇单加氧酶，催化神经醇的C9位选择性羟基化；PP1957编码的PFOR可有效向CYP238A1传递电子，可能是其生理电子传递伙伴。该研究为利用P450系统进行萜烯醇生物转化提供了新元件和策略。