Cloning and characterization of a novel β-carotene hydroxylase gene from Lycium barbarum and its expression in Escherichia coli
- 作者
- Jiang Wu, Jing Ji, Gang Wang, Zhaodi Li, Jinjin Diao, Guangxia Wu
- 单位
- School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University; School of Environmental Science and Engineering, Tianjin University
- 杂志
- Biotechnology and Applied Biochemistry（2014）
- DOI
- 10.1002/bab.1224
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从枸杞中克隆β-胡萝卜素羟化酶基因（chyb）并验证其功能，以实现玉米黄质在大肠杆菌中的生物合成。
研究策略
利用3'RACE克隆枸杞chyb cDNA，进行生物信息学分析，构建pET-28a-Lbcbyb表达载体，与pACCAR16ΔcrtX共转化大肠杆菌进行功能互补实验，并通过HPLC检测产物。
研究路线图
核心内容
本研究从枸杞中首次克隆了β-胡萝卜素羟化酶基因chyb的cDNA序列，该基因开放阅读框长939 bp，编码312个氨基酸，预测蛋白分子量约34.8 kDa。通过3'RACE技术获得全长序列并进行生物信息学分析后，构建了pET-28a-Lbcbyb表达载体，将其与能够积累β-胡萝卜素的pACCAR16ΔcrtX质粒共转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，通过功能互补实验验证酶活性。HPLC检测结果显示，共表达菌株的总类胡萝卜素中β-胡萝卜素占45.1%±0.5%，玉米黄质占54.9%±0.9%，证明该酶可有效催化β-胡萝卜素向玉米黄质的羟化反应。此外，组织表达分析表明枸杞果实中chyb表达量较茎部高约19倍，提示其与果实中类胡萝卜素积累密切相关。该研究为利用大肠杆菌异源合成玉米黄质提供了可行的遗传操作元件，也为枸杞及其他植物的类胡萝卜素代谢工程改良奠定了基因资源基础。
创新点
首次从枸杞中克隆并鉴定β-胡萝卜素羟化酶基因chyb，证明其在大肠杆菌中具有催化β-胡萝卜素转化为玉米黄质的功能。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成 | chyb | β-胡萝卜素羟化酶 (Chyb) | 催化 | 来源于枸杞，催化β-胡萝卜素转化为玉米黄质，通过功能互补实验验证 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成 | crtX (缺失) | 无 | 催化 | 质粒pACCAR16ΔcrtX用于积累β-胡萝卜素作为底物 |
关键发现
- 克隆获得939 bp的chyb ORF，编码312个氨基酸的蛋白，分子量约34.8 kDa，理论pI为8.36
- 在大肠杆菌共表达中，总类胡萝卜素中β-胡萝卜素占45.1%±0.5%，玉米黄质占54.9%±0.9%
- 枸杞果实中chyb表达量较茎中高约19倍。
研究结论
枸杞chyb基因编码的β-胡萝卜素羟化酶具有催化β-胡萝卜素羟化生成玉米黄质的活性，为通过大肠杆菌遗传操作生产玉米黄质提供了途径，并可用于植物类胡萝卜素代谢工程改良。